王立光 陳軍 葉春雷 羅俊杰

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，蘭州 730070）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為第一個(gè)完成基因組測序的真核生物［1］，在現(xiàn)代分子生物學(xué)中作為重要的真核模式生物，具有重要的科研應(yīng)用價(jià)值。釀酒酵母具有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞，基因組小，生命周期短，繁殖迅速，再加上其大部分基因功能都已得到驗(yàn)證且又與植物和動(dòng)物細(xì)胞具有很多相同結(jié)構(gòu)，因此往往被用于基因功能鑒定。理論上，和酵母任何一種遺傳學(xué)特征相對(duì)應(yīng)的不同生物的結(jié)構(gòu)基因都能通過互補(bǔ)作用在釀酒酵母缺失突變體內(nèi)得到鑒定［2-5］。單細(xì)胞真核生物釀酒酵母作為一種在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究方面具有許多內(nèi)在優(yōu)勢的模式生物，為高等真核生物提供一個(gè)檢測系統(tǒng)。

Na+，K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na+，K+/H+exchanger，NHXs）是一類跨膜反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于一價(jià)陽離子 /H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Cation/proton antiporter，CPA）基因家族中的CPA1亞家族，它們的生化活力是將Na+或K+與質(zhì)子（H+）進(jìn)行跨膜反向轉(zhuǎn)運(yùn)［6-8］。NHXs在細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物等生物體內(nèi)廣泛存在，并且一般具有多個(gè)家族成員，其在逆境響應(yīng)、膜微囊運(yùn)輸、蛋白存儲(chǔ)、細(xì)胞生長、pH調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、離子平衡及生長發(fā)育等生理生化過程中起著重要的作用［9-15］。根據(jù)進(jìn)化分析和亞細(xì)胞定位，一般將NHXs分為三類：一類是定位于質(zhì)膜上的成員，如擬南芥和胡楊的AtNHX7/SOS1、AtNHX8、PeSOS1；一類為定位于液胞膜上的成員，如擬南芥的AtNHX1-4；還有一類是定位于內(nèi)膜（EndosomalNHXs）上的成員，如擬南芥和番茄的 AtNHX5-6、LeNHX2［6，9-11］。模式植物擬南芥中質(zhì)膜上的AtNHX7/SOS1的作用及機(jī)制研究的比較清楚，液胞膜上的4個(gè)反向轉(zhuǎn)運(yùn)體在抗逆中的作用也得到了廣泛研究，而內(nèi)膜成員的研究近幾年才獲得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展［16-26］。人們通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將獲得鑒定的NHX基因轉(zhuǎn)到作物及樹木中，得到了抗鹽、抗旱及高產(chǎn)的改良品種［27-35］。因此，鑒定檢測新的NHX基因尤其抗逆性強(qiáng)的生物體內(nèi)的NHX基因，將對(duì)進(jìn)一步深入了解它們的功能及創(chuàng)制新種質(zhì)都具有重要的意義。

釀酒酵母NHX1基因編碼的Na+，K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體是酵母CPA家族的重要成員，定位于液胞膜和內(nèi)膜系統(tǒng)，對(duì)維持離子動(dòng)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)pH及液胞融合起著重要的作用［36-37］。因此，建立釀酒酵母NHX1基因缺失突變菌株以用于植物或動(dòng)物NHX基因的鑒定及功能研究具有重要意義。本研究利用側(cè)翼同源PCR構(gòu)建含有KanMX選擇標(biāo)記基因及與釀酒酵母NHX1基因序列上下游同源的基因敲除組件，通過同源重組的方式成功敲除酵母NHX1基因，構(gòu)建了具有G418抗性的BJ3505NHX1基因缺陷型突變株，并通過互補(bǔ)試驗(yàn)對(duì)酵母NHX1基因的功能及突變菌株進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 釀酒酵母BJ3505（Saccharomyces cerevisiaeBJ3505）、 大 腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α、質(zhì)粒 pFA6a-kanMX6、pDR196。

1.1.2 主要試劑與儀器 Taq DNA Polymerase（Fermentas）用于突變株鑒定；高保真PrimeSTARTMHS DNA Polymerase（TaKaRa）用于基因克隆和敲除組建克??；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)marker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、酵母DNA提取試劑盒均購自天根試劑公司產(chǎn)品；G418和FM4-64購自索萊寶公司；PCR儀和電泳儀設(shè)備為Bio-Rad；搖床、培養(yǎng)箱購自上海一恒；激光共聚焦顯微鏡（Olympus）。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 大腸桿菌培養(yǎng)基為LB（1.0%胰化蛋白胨，1.0%氯化鈉，0.5%酵母提取物，pH 7.0，固體培養(yǎng)基需加入1.5%的瓊脂）培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。BJ3505酵母菌基突變株培養(yǎng)基為YPD（1.0%酵母提取物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖，固體培養(yǎng)基需加入2.0%瓊脂）和YPD+G418培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)?；パa(bǔ)菌株篩選及生長培養(yǎng)基為SCURA+G418選擇培養(yǎng)基。部分酵母生長實(shí)驗(yàn)在AP（10 mmol/L精氨酸，8.0 mmol/L磷酸，2.0 mmol/L硫酸鎂，1.0 mmol/L氯化鉀，0.2 mmol/L氯化鈣，2.0%的葡萄糖，微量元素及維生素）培養(yǎng)基上進(jìn)行。

1.1.4 引物 本研究所用各引物序列見表1，根據(jù)質(zhì)粒和基因已知序列利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由華大基因公司合成。

1.2 nhx1突變菌株及互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

1.2.1 BJ3505Δnhx1突變株的構(gòu)建及篩選驗(yàn)證 以質(zhì)粒pFA6a-kanMX6為模板，用Ko-F和Ko-R引物擴(kuò)增獲得敲除組件［38-39］。PCR反應(yīng)條件：98℃5 min ；98℃ 10 s、69℃ 15 s、72℃ 100 s，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳，膠回收純化?；厥斋@得的目的產(chǎn)物利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BJ3505，利用G418抗性篩選陽性菌落，獲得單菌落進(jìn)一步在含有200 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)板上篩選。對(duì)獲得具有抗性的菌株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并提取DNA，利用酵母NHX1基因上游引物NHX-F與NHX1基因序列內(nèi)引物NHX-R或KanMX序列內(nèi)引物KanMX-R進(jìn)一步鑒定驗(yàn)證。

1.2.2 互補(bǔ)菌株（BJ3505Δnhx1-C）的構(gòu)建及篩選驗(yàn)證 為了確定BJ3505Δnhx1的缺陷表型是由NHX1基因缺失引起的，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了功能互補(bǔ)菌株，以驗(yàn)證其表型能否恢復(fù)。提取BJ3505基因組DNA作為模板，用帶有酶切位點(diǎn)的引物ScNHX1-Sal1-F和ScNHX1-Xho1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到NHX1基因的開放閱讀框，經(jīng)酶切膠回收后與相同內(nèi)切酶雙酶切的pDR196載體酶連，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)化載體pDR196-NHX1，經(jīng)測序正確后利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)入BJ3505Δnhx1突變株中，在含有G418的SC-URA選擇培養(yǎng)板上篩選，獲得的陽性菌株擴(kuò)增培養(yǎng)并提取酵母總DNA，以此為模板，利用引物pDR96-F和pDR96-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。同時(shí)，空載質(zhì)粒pDR196作為對(duì)照也轉(zhuǎn)入BJ3505Δnhx1突變株中并篩選獲得陽性菌株。

表1 引物序列

1.2.3 BJ3505Δnhx1和互補(bǔ)菌株的抗逆能力測定 為了研究抗逆耐受，將用于實(shí)驗(yàn)的菌株先在相應(yīng)的篩選板上劃線培養(yǎng)。挑取單菌落接到AP培養(yǎng)基中震蕩過夜培養(yǎng)，5 000×g離心后用無菌去離子水懸浮，再次離心，重復(fù)漂洗3次。用酶標(biāo)儀測定菌液OD600值，調(diào)整起始濃度為0.12，10倍梯度稀釋后取樣4 μL點(diǎn)在含有NaCl、LiCl或潮霉素的YPD板或含有KCl的AP板上，培養(yǎng)板倒置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，根據(jù)菌落生長情況鑒定抗逆能力。

1.2.4 BJ3505Δnhx1和互補(bǔ)菌株的液胞形態(tài)觀察 試驗(yàn)菌株在篩選板上劃板培養(yǎng)，挑取單菌落接種到液體篩選培養(yǎng)基內(nèi)震蕩過夜培養(yǎng)，取100 μL菌液加入到含有10 mmol/L FM4-64的YPD培養(yǎng)液中，置于搖床內(nèi)30℃過夜培養(yǎng)。取1.0 mL菌液放于離心管內(nèi)，4℃ 4 000 r/min離心2 min，用PBS漂洗，再次離心，重復(fù)3次后用150 μL PBS懸浮菌體，取懸浮菌液20 μL，已熔冷卻至50℃的0.6%瓊脂糖溶液20 μL，加入同一離心管內(nèi)混勻，取15 μL滴于載玻片中央，蓋好蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察液胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 突變菌株構(gòu)建結(jié)果

2.1.1 敲除組件擴(kuò)增結(jié)果 以質(zhì)粒pFA6a-kanMX6為模板，擴(kuò)增大小為1 560 bp的敲除組件片段，核酸電泳結(jié)果（圖1）顯示得到與預(yù)期大小相符的單一片段條帶；膠回收測序鑒定與預(yù)期序列信息完全符合。

圖 1 PCR擴(kuò)增敲除組件

2.1.2 突變菌株鑒定 利用醋酸鋰法將純化的敲除組件導(dǎo)入釀酒酵母BJ3505，通過同源重組敲除酵母NHX1基因，經(jīng)PCR鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果。突變菌株可以用引物NHX1-F和KanMX-R擴(kuò)增出1 220 bp的條帶，而引物NHX1-F和NHX1-R不能擴(kuò)增出條帶。野生型酵母可以用引物NHX1-F和NHX1-R擴(kuò)增出817 bp的條帶，而用引物NHX1-F和KanMX-R不能擴(kuò)出條帶。由于引物NHX1-R和KanMX-R分別是位于酵母基因NHX1和敲除組件內(nèi)的序列，與酵母NHX1基因上游的引物NHX1-F組合，擴(kuò)增結(jié)果說明同源重組整合成功，得到NHX1基因敲除突變菌株（圖 2）。

圖 2 NHX1突變體驗(yàn)證

2.2 互補(bǔ)菌株構(gòu)建結(jié)構(gòu)篩選結(jié)果

以BJ3505總基因組DNA為模板，擴(kuò)增包含酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基在內(nèi)的NHX1基因完整的開放閱讀框1 920 bp（圖3），經(jīng)酶切后與相同雙酶切的載體pDR196酶連構(gòu)建互補(bǔ)載體pDR196-NHX1。將測序正確的pDR196-NHX1利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入酵母突變株BJ3505Δnhx1內(nèi)，經(jīng)含有G418的SC-URA篩選培養(yǎng)基篩選，利用引物pDR96-F和pDR96-R進(jìn)行PCR鑒定。構(gòu)建成功的互補(bǔ)菌株中可以擴(kuò)增出2 353 bp的片段，而未導(dǎo)入互補(bǔ)載體的突變菌株擴(kuò)增不出條帶，證明互補(bǔ)菌株構(gòu)建成功（圖4）。為進(jìn)一步確定互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)入成功，我們提取酵母中的質(zhì)粒，進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明酵母中存在的質(zhì)粒為轉(zhuǎn)入成功的互補(bǔ)質(zhì)粒。

圖 3 NHX1基因克隆

2.3 BJ3505Δnhx1和互補(bǔ)菌株的抗逆能力測定結(jié)果

圖 4 互補(bǔ)菌株P(guān)CR鑒定

為了檢測酵母ScNHX1的離子轉(zhuǎn)運(yùn)特性及突變菌株對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)能力，我們進(jìn)行了脅迫條件下的酵母平板生長實(shí)驗(yàn)。酵母生長實(shí)驗(yàn)分別在含有潮霉素B、氯化鈉或氯化鋰的YPD培養(yǎng)基上或含有高濃度氯化鉀的AP培養(yǎng)基上進(jìn)行（圖5）。酵母突變體 BJ3505Δnhx1在含有 800 mmol/L KCl、150 mmol/L NaCl或12 mmol/L LiCl的培養(yǎng)基上生長受到嚴(yán)重抑制，而在同等條件下野生型酵母BJ3505可以正常生長（圖5-A-C）。酵母NHX1可以恢復(fù)突變株BJ3505Δnhx1對(duì)高鉀、高鹽或高鋰的耐受能力，表達(dá)了ScNHX1的互補(bǔ)菌株的生長與野生型菌株生長相近，而轉(zhuǎn)入空載pDR196質(zhì)粒的突變菌株未恢復(fù)其耐受性。BJ3505Δnhx1酵母突變菌對(duì)潮霉素B（50 μg/mL）敏感，但互補(bǔ)菌株表現(xiàn)出與野生型接近的潮霉素B耐受性（圖5-D），這暗示ScNHX1可能參與膜微囊運(yùn)輸過程。這些結(jié)果表明，ScNHX1在酵母內(nèi)調(diào)節(jié)K+、Na+及Li+的動(dòng)態(tài)平衡，酵母NHX1基因的缺失導(dǎo)致突變株BJ3505Δnhx1抗逆能力降低，也從另一方面證明酵母突變株構(gòu)建成功。

2.4 BJ3505Δnhx1和互補(bǔ)菌株液胞形態(tài)

熒光染料FM4-64染色的酵母在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，酵母突變體BJ3505Δnhx1液胞形態(tài)異常，表現(xiàn)為一個(gè)酵母內(nèi)存在多個(gè)液胞，而野生型及互補(bǔ)菌株表現(xiàn)為單液胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)入空載體的突變菌株中液胞也未恢復(fù)到野生型酵母水平（圖6）。這些現(xiàn)象說明，利用此法使酵母NHX1基因缺失導(dǎo)致液胞融合過程發(fā)生了改變，引起了液胞結(jié)構(gòu)異常。

3 討論

圖 5 BJ3505Δnhx1和BJ3505Δnhx1-C抗逆性結(jié)果

圖 6 BJ3505Δnhx1和BJ3505Δnhx1-C液胞形態(tài)

酵母利用同源重組敲除基因的方法簡單易行，可以在不影響基因組內(nèi)其它功能基因的情況下對(duì)目的基因精準(zhǔn)敲除。虞蘭蘭等［40］利用部分缺失的外源leu2片段取代了酵母染色體上的正常LEU2基因，構(gòu)建了克魯式乳酸酵母leu2突變體。Rothstein等［41］對(duì)一步中斷法敲除基因的方法進(jìn)行了研究，證明了該方法的可行性。Gaxiola等［42］利用篩選標(biāo)記基因?qū)湍付鄠€(gè)基因進(jìn)行了同源重組敲除，通過功能互補(bǔ)對(duì)植物中相似基因進(jìn)行了研究。Qiu等［43-44］也通過對(duì)酵母NHX1基因的敲除構(gòu)建了nhx1突變株，發(fā)現(xiàn)酵母NHX1調(diào)節(jié)酵母液胞融合的起始過程。本文所用一步基因中斷法具有突變位點(diǎn)明確，突變機(jī)制清楚，突變效率高及穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，通過已知選擇基因KanMX序列與染色體上目的基因的同源重組與取代，成功敲除了NHX1基因，構(gòu)建了穩(wěn)定的釀酒酵母BJ3505的突變體（圖1，圖2），并成功克隆NHX1基因，得到互補(bǔ)菌株BJ3505Δnhx1-C（圖3，圖4），進(jìn)一步通過互補(bǔ)試驗(yàn)對(duì)酵母NHX1基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證（圖5，圖6）。構(gòu)建獲得的釀酒酵母BJ3505Δnhx1突變體將為新克隆的NHX基因的功能驗(yàn)證提供便利。

在植物中一般認(rèn)為質(zhì)膜NHXs負(fù)責(zé)向胞外排出Na+，液胞膜NHXs將Na+區(qū)域化到液胞中，而內(nèi)膜NHXs在內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)的Na+運(yùn)輸具有重要作用，且大部分NHXs具有K+轉(zhuǎn)運(yùn)功能。同時(shí)，在擬南芥內(nèi)研究表明，不同的AtNHXs對(duì)離子的偏好性具有差異，AtNHX1偏好K+，AtSOS1/NHX7偏好 Na+，AtNHX8偏好 Li+，而 AtNHX5 和 AtNHX6 偏好 Na+和 K+［45］。雖然在酵母體內(nèi)還有ENA、NHA、KHA等離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的存在，但是NHX1基因的缺失，使NHX1蛋白不能在酵母體內(nèi)合成，相應(yīng)的功能缺失，導(dǎo)致突變菌株對(duì)逆境脅迫敏感，降低抗逆能力，液胞形態(tài)異常（圖5，圖6），本實(shí)驗(yàn)得到與相關(guān)報(bào)道相一致的結(jié)果［43，46-48］，說明釀酒酵母NHX1反向轉(zhuǎn)運(yùn)體在酵母體內(nèi)具有不可替代的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，釀酒酵母NHX1基因的缺失導(dǎo)致對(duì)Na+、K+和Li+的耐受性都降低，而互補(bǔ)NHX1可以恢復(fù)耐受能力，說明NHX1具有對(duì)這些離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，這也預(yù)示酵母NHX1可能同時(shí)具有擬南芥各成員NHXs的偏好轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

有研究表明，擬南芥內(nèi)膜NHXs在囊泡運(yùn)輸和融合過程具有重要作用，酵母NHX1調(diào)節(jié)液胞融合的起始過程，說明二者在液胞融合中具有相似的功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，敲除酵母NHX1基因?qū)е乱喊螒B(tài)異常，出現(xiàn)多液胞現(xiàn)象，這再次證明酵母缺失NHX1會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)致蛋白相應(yīng)功能喪失，液胞融合活力降低（圖6）。釀酒酵母NHX1是具有12個(gè)跨膜區(qū)的離子反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，其轉(zhuǎn)運(yùn)功能對(duì)調(diào)節(jié)液胞、細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)離子和pH的動(dòng)態(tài)平衡具有決定性的作用，這也就會(huì)導(dǎo)致其缺失致使酵母表現(xiàn)出明顯的特征，如抗逆性降低、液胞形態(tài)異常等。因此，利用酵母已知功能的NHX1的缺失突變體可以檢測高等生物某一未知功能蛋白是否具有相似的功能，或?qū)σ恍┮阎狽HX進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)也具有重要意義。擬南芥AtNHX1、AtSOS1的功能就在酵母nhx1突變體內(nèi)得到了證實(shí)及驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究利用同源重組法成功的構(gòu)建了NHX1基因缺失突變株，并通過實(shí)驗(yàn)證明釀酒酵母NHX1作為重要的離子反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，在釀酒酵母BJ3505抵抗外界脅迫環(huán)境和液胞融合過程中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)，通過互補(bǔ)試驗(yàn)對(duì)酵母突變體構(gòu)建的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。