謝長林 吳季輝 唐雅珺

（1. 中國科學(xué)院 強(qiáng)磁場科學(xué)中心，合肥 230031；2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230026）

在高等生物中，DNA是遺傳信息的主要載體。真核生物的DNA并不是裸露的，而是與細(xì)胞內(nèi)的四種富含堿性氨基酸的組蛋白結(jié)合形成直徑大約10 nm的核小體。核小體是處于動態(tài)的變化中，它不斷的組裝與去組裝，同時形成不同的變體核小體［1］。在核小體上存在著許多翻譯后修飾，包括甲基化、泛素化、乙?；?、SUMO化和糖基化等多種修飾，這些修飾的寫入和擦除是基因調(diào)控的重要方式［2-3］。核小體重塑與去乙?；福∟ucleosome remodeling and deacetylation，NuRD）復(fù)合物是一種具有核小體重塑及組蛋白去乙酰化功能的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，其核心組分包括CHD3/4、HDAC1/2、MBD2、MBD3、MTA1/2/3、GATAD2A/B 和 RBBP4/7［4-6］。NuRD廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞發(fā)育以及細(xì)胞周期調(diào)控等一系列生命活動［7-9］。NuRD參與細(xì)胞活動的過程中，能夠與不同的結(jié)合底物相互作用共同完成調(diào)節(jié)功能。NuRD的核心組分GATAD2A/B和RBBP4/7作為媒介能介導(dǎo)NuRD與結(jié)合底物之間的相互作用。其中，RBBP4也是多梳抑制復(fù)合物 2（Polycomb repressive complex 2，PRC2）的組分之一。作為NuRD和PRC2兩種復(fù)合物中的共同亞基，RBBP4已經(jīng)鑒定出多種結(jié)合底物幫助二者實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)功能［10-13］。在這些結(jié)合底物中，有一類結(jié)合底物可以通過其自身的一段保守的富含精氨酸和賴氨酸的區(qū)域參與RBBP4的相互作用，這段富含堿性氨基酸的序列通常以RXXP模塊的形式出現(xiàn)［10］。RBBP4全長425個氨基酸，屬于WD40蛋白質(zhì)，由氮端的長α螺旋和一個七螺旋槳組成［14］，如圖1-A所示。上述的RXXP模塊與RBBP4之間存在一種保守的相互作用模式，模塊中的一個精氨酸將其側(cè)鏈伸入RBBP4頂端的口袋之中，與RBBP4上的殘基形成氫鍵和疏水性的相互作用。

ZMYND8包含一個PHD結(jié)構(gòu)域，一個BROMO結(jié)構(gòu)域，一個PWWP結(jié)構(gòu)域和一個碳端的MYND結(jié)構(gòu)域，如圖 2-A所示。在細(xì)胞內(nèi)，ZMYND8主要參與調(diào)節(jié)同源重組相關(guān)的DNA損傷修復(fù)以及癌細(xì)胞分化與侵襲［15］。最初的研究發(fā)現(xiàn)，它在T細(xì)胞淋巴瘤中的胚胎神經(jīng)分化過程中發(fā)揮著重要功能［16］。在癌癥相關(guān)的生命活動中，ZMYND8是全反式維甲酸（All-trans-retinoic acid，ATRA）介導(dǎo)的抗腫瘤細(xì)胞增生過程中的底物蛋白［17-18］。ZMYND8還可以與H3K4me3的特異性去甲基化酶KDM5C結(jié)合來共同調(diào)控增強(qiáng)子的活性，從而抑制部分癌癥相關(guān)基因的過表達(dá)［19］。作為H3K4去甲基轉(zhuǎn)移酶JARID1D轉(zhuǎn)錄的共抑制因子，ZMYND8可以通過其PHD和BROMO結(jié)構(gòu)域組合而成的識別元件識別H3K4me1-H3K14ac來抵抗與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)［20］。ZMYND8的多個串聯(lián)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成剛性的元件，識別組蛋白的多種修飾［20-21］。在體內(nèi)，ZMYND8相較于變體H3能夠優(yōu)先識別傳統(tǒng)的H3上的K36me2。此外，ZMYND8還能夠識別的H4K16ac［17］。在轉(zhuǎn)錄過程中，ZMYND8響應(yīng)DNA損傷后，通過其BROMO結(jié)構(gòu)域結(jié)合在H4K16ac上，進(jìn)而招募NuRD至損傷區(qū)域抑制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，促進(jìn)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)［22］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ZMYND8參與招募NuRD的相互作用方式是ZMYND8能夠通過自身碳端的MYND鋅指結(jié)構(gòu)域與NuRD亞基GATAD2A中的PPPL模塊相互作用來確保二者共定位于DNA損傷位點(diǎn)［23］。ZMYND8和NuRD之間是否還存在更廣泛的相互作用來實(shí)現(xiàn)二者的共定位有待于進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)通過對ZMYND8一級序列的分析，發(fā)現(xiàn)ZMYND8上存在5段可能與RBBP4相互作用的富含堿性氨基酸殘基的區(qū)域。重組蛋白RBBP4與體外合成的小肽的等溫量熱滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RBBP4可以特異性地結(jié)合ZMYND843-54區(qū)域，親和力為7.9 μmol/L。根據(jù)已知的RBBP4與其他小肽底物的復(fù)合物模型，對RBBP4上可能參與相互作用的殘基進(jìn)行了點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，初步確定了ZMYND43-54與RBBP4的相互作用界面。結(jié)合以往的研究成果，我們提出了ZMYND8和NuRD在體內(nèi)發(fā)揮功能時的結(jié)合模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 克隆宿主菌Top10，感受態(tài)DH10ac，重組質(zhì)粒pFastBacTM，來自粉紋夜蛾（Trichopulsia ni）的High Five細(xì)胞，上述材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基；昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基采用ESF921培養(yǎng)基，購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 試劑 PCR的引物合成和重組質(zhì)粒的測序均有南京金斯瑞公司完成；DNA聚合酶PimerSTAR MAX和連接酶混合體系Solution I購于TaKaRa公司；DNA限制性內(nèi)切酶，DNA Marker和蛋白質(zhì)Marker購于Thermo fisher scientific公司；DNA膠回收試劑盒E.Z.N.A購于美國Omega Bio-tek公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購于Axygen公司；其他實(shí)驗(yàn)過程中使用到的試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)的分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 RBBP4的昆蟲細(xì)胞表達(dá) 利用PCR技術(shù)從人腦cDNA文庫中擴(kuò)增出RBBP4的全長基因。目的基因片段經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切后亞克隆至pFastBac質(zhì)粒中，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中。準(zhǔn)備三抗（50 μg/mL 卡那霉素，7 μg/mL 慶大霉素，10 μg/mL 四環(huán)素）平板，平板上添加 40 μL X-gal（20 mg/mL）和 4 μL IPTG（200 mg/mL）。將轉(zhuǎn)化液涂布到平板上，避光37℃培養(yǎng)36-48 h。待平板上的藍(lán)白斑區(qū)分明顯之后，挑取白斑接種至三抗的液體LB培養(yǎng)基中。鑒定片段插入成功后，抽提Bacmid轉(zhuǎn)染High Five細(xì)胞。逐步擴(kuò)增獲得滴度高的P3代桿狀病毒。懸浮培養(yǎng)High Five細(xì)胞至濃度1.0×106cells/well，添加適合體積的P3代病毒，27℃，115 r/min搖床培養(yǎng)3-4 d，收集細(xì)胞。

1.2.2 RBBP4的體外純化 收集的昆蟲細(xì)胞，超聲破碎，超速離心后收集上清液。上清液轉(zhuǎn)移至Ni-NTA柱純化。純化流程如下：緩沖液A（20 mmol/L Tris pH 8.0，500 mmol/L NaCl）平衡Ni-NTA柱。上清液流穿后，用含有20 mmol/L到100 mmol/L咪唑的緩沖液梯度清洗雜蛋白，最后用500 mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白。洗脫液濃縮后，進(jìn)一步Hiload 16/60 Superdex 200（GE Healthcare）柱純化。目的蛋白峰收集透析至緩沖液B（20 mmol/L Tris pH 7.4，150 mmol/L NaCl）備用。

1.2.3 小肽合成 實(shí)驗(yàn)中所使用的蛋白質(zhì)小肽均由吉爾生化（上海）有限公司合成，純度在95%以上。

1.2.4 等溫量熱滴定實(shí)驗(yàn) ITC使用的儀器為ITC2000（GE Healthcare）。實(shí)驗(yàn)中，小肽的濃度在1-3 mmol/L，蛋白質(zhì)濃度為20-60 μmol/L。小肽和蛋白質(zhì)均在緩沖液B中，實(shí)驗(yàn)溫度20℃，滴定次數(shù)為20次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理使用的是ITC2000自帶的Origin軟件。

2 結(jié)果

2.1 RBBP4的體外純化與鑒定

在大腸桿菌表達(dá)體系中，無法在上清中獲得可溶的RBBP4蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，能夠在上清溶液中檢測到目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。隨后的Superdex 200 凝膠過濾柱層析純化過程中，RBBP4在波長280 nm的層析圖譜顯示（圖 1-B），在82.59 mL處出現(xiàn)重組蛋白質(zhì)的單一峰。純化后的RBBP4經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果（圖 1-C）顯示為均一的條帶，表明目的蛋白質(zhì)已經(jīng)達(dá)到電泳純，其相對分子質(zhì)量大約在45 kD左右。這與理論計算的重組RBBP4的分子量相近，結(jié)合RBBP4在層析圖中的出峰位置，表明RBBP4在溶液中呈現(xiàn)單體的狀態(tài)。

圖1 RBBP4的體外純化與鑒定

2.2 篩選ZMYND8上與RBBP4相互作用區(qū)域

ZMYND8的全長序列分析結(jié)果（圖2-B）顯示，5段富含精氨酸和賴氨酸的堿性區(qū)域具有與RBBP4結(jié)合的潛力。這些區(qū)域包括氨基酸殘基：16-30（ZMYND816-30），43-54（ZMYND843-54），201-213（ZMYND8201-213），331-344（ZMYND331-344） 和 352-364（ZMYND8352-364）?；谏鲜鲂蛄?，化學(xué)合成相應(yīng)的小肽，利用ITC技術(shù)來檢測小肽與RBBP4的相互作用。

ITC的滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 2-B和2-C）顯示：RBBP4不結(jié)合小肽 ZMYND816-30，ZMYND8201-213和ZMYND8331-344。ZMYND843-54對RBBP4表現(xiàn)出強(qiáng)的結(jié)合能力，擬合的解離常數(shù)（KD）為7.9±1.9 μmol/L。此外，ZMYND8352-364滴定 RBBP4的KD值為129.3±14.9 μmol/L，表明其對RBBP4呈現(xiàn)非常弱的親和力。ZMYND843-54對RBBP4結(jié)合能力與已經(jīng)報道的體內(nèi)的結(jié)合底物對RBBP4的親和力一致，量級在10 μmol/L左右。

2.3 ZMYND843-54與RBBP4結(jié)合界面的初步鑒定

ZMYND843-54位于蛋白質(zhì)氮端的無序區(qū)域，與RBBP4的結(jié)合能力體現(xiàn)了此區(qū)域?qū)MYND8行使功能的重要性。將不同種屬的ZMYND8氮端序列進(jìn)行比對，結(jié)果（圖 3-A）顯示從低等生物到高等生物，不同種屬的ZMYND8氮端區(qū)域都對人源的ZMYND843-54表現(xiàn)出非常強(qiáng)的保守性。這也暗示了這段區(qū)域在不同種屬中都能介導(dǎo)保守的相互作用。分析已經(jīng)報道的RBBP4與底物小肽的晶體結(jié)構(gòu)，二者之間存在兩種保守的相互作用方式。如圖3-B顯示：第一種：不同的結(jié)合小肽包含一個保守的精氨酸，其側(cè)鏈深入RBBP4頂端的口袋內(nèi)，與RBBP4上的181位的絡(luò)氨酸和321位的苯丙氨酸形成π鍵，同時還能與231位的谷氨酸和277位的天冬酰胺形成氫鍵和靜電相互作用；第二種：不同的結(jié)合小肽中均包含另一個保守的脯氨酸結(jié)合在RBBP4上的43位的脯氨酸、71位的組氨酸以及73位的絲氨酸構(gòu)成的疏水口袋中。

圖2 鑒定ZMYND8上與RBBP4相互作用的區(qū)域

以此種方式與RBBP4結(jié)合的底物包括PHF6、BCL11a和FOG1。ZMYND843-54與這些結(jié)合底物的序列比對結(jié)果（圖3-C）顯示，ZMYND843-54可能屬于此類結(jié)合模式，特別是ZMYND8上第48脯氨酸表現(xiàn)出嚴(yán)格的保守性。為了進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)確定其結(jié)合位點(diǎn)，我們對RBBP4上可能與ZMYND8的48位脯氨酸存在相互作用的第43位的脯氨酸及第71位的組氨酸進(jìn)行了雙點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)。ZMYND843-54對RBBP4（P43A/H71A）突變體的親和力為51.0±7.5 μmol/L，與野生型的RBBP4的親和力相比下降了約6.5倍左右（圖3-D）。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZMYND843-54結(jié)合在RBBP4的頂端區(qū)域。

圖3 ZMYND843-54與RBBP4結(jié)合界面的初步鑒定

2.4 體內(nèi)ZMYND8與NuRD結(jié)合模型

ZMYND8是一個具有多個串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。近期的研究顯示，ZMYND8能夠通過自身碳端的鋅指MYND結(jié)構(gòu)域與NuRD復(fù)合物的GATAD2A中的PPPL模塊相互作用來幫助NuRD招募至DNA損傷位點(diǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZMYND8氮端的43-54氨基酸殘基能夠與NuRD的亞基RBBP4結(jié)合，且結(jié)合界面與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合底物PHF6，BCL11a和FOG1一致。綜合所有的研究發(fā)現(xiàn)，ZMYND8與NuRD的結(jié)合模型，如圖4所示，ZMYND8通過氮端的43-54氨基酸殘基與亞基RBBP4結(jié)合，同時其碳端的MYND結(jié)構(gòu)域與亞基GATA2A結(jié)合。這樣的相互作用模式能夠使得ZMYND8以舒展的方式纏繞在NuRD的表面。此后，位于ZMYND8中間的PHD、BROMO和PWWP結(jié)構(gòu)域能夠進(jìn)一步識別串聯(lián)排列的各種組蛋白修飾，如H3K4me1、H3K14ac和H4K16ac等。

圖4 ZMYND8與NuRD體內(nèi)結(jié)合模型

3 討論

以往的研究表明NuRD復(fù)合物與DNA損傷有關(guān)，它能夠輔助DNA損傷的響應(yīng)［24-26］。然而對于NuRD如何定位到損傷的DNA區(qū)域的研究還不夠充分。ZMYND8是一個既能結(jié)合染色質(zhì)又能與NuRD相互作用的重要媒介。它與NuRD一起形成復(fù)合物來幫助損傷修復(fù)的響應(yīng)。前期的研究表明ZMYND8中的MYND結(jié)構(gòu)域能夠識別NuRD亞基GATA2A中的PPPL模塊，來實(shí)現(xiàn)二者的共定位［23］。然而上述的研究并未充分的闡述ZMYND8與NuRD二者之間廣泛的相互作用模式。RBBP4是NuRD的一個重要的核心亞基，本實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證了它能夠通過自身β桶結(jié)構(gòu)的頂端區(qū)域結(jié)合位于ZMYND8氮端的43-54位殘基。這樣的相互作用可能與DNA損傷響應(yīng)過程中NuRD的招募有關(guān)?？偨Y(jié)已經(jīng)報道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，NuRD與底物蛋白的結(jié)合是通過多個亞基實(shí)現(xiàn)的。在DNA損傷修復(fù)的過程中，ZMYND8通過其氮端43-54位殘基和碳端的MYND結(jié)構(gòu)域來介導(dǎo)與NuRD之間的相互作用，這樣的結(jié)合方式能夠使得ZMYND8更加剛性和牢固的結(jié)合在NuRD的周圍。而上述兩種相互作用的功能意義還有待于我們進(jìn)一步的探索研究。

分析RBBP4與底物小肽的結(jié)合特點(diǎn)，保守的結(jié)合模式為小肽中的一個精氨酸伸入RBBP4的頂端口袋中，同時距離其3到4位存在一個保守的脯氨酸，這種序列特點(diǎn)可被歸納為RXXP模塊。這種保守的結(jié)合模式也為尋找新的RBBP4結(jié)合底物提供一定的依據(jù)。然而，此次研究鑒定出ZMYND8上與RBBP4的相互作用區(qū)域的43-54殘基中并不包含保守的精氨酸，而是含有一個替代精氨酸的賴氨酸。這一結(jié)果也說明傳統(tǒng)的RXXP模塊并不是RBBP4識別的唯一模塊類型，替代的賴氨酸同樣能夠完成識別RBBP4的作用。

4 結(jié)論

本研究利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，重組表達(dá)了人源NuRD的核心亞基RBBP4蛋白。經(jīng)過鎳柱以及分子篩純化，獲得了電泳純的重組目的蛋白。同時，通過ITC實(shí)驗(yàn)我們鑒定出ZMYND843-54是介導(dǎo)與RBBP4相互作用的區(qū)域。利用氨基酸殘基的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，初步確定了二者相互作用的界面。新發(fā)現(xiàn)的結(jié)合區(qū)域完善了ZMYND8與NuRD復(fù)合物相互作用的模式。上述的研究發(fā)現(xiàn)有助于我們更加全面的理解NuRD復(fù)合物如何與ZMYND8一起共同參與到轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA損傷修復(fù)等一系列生命活動中。