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(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所,海南萬(wàn)寧 571533; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070; 3.國(guó)家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心,海南萬(wàn)寧 571533; 4.海南省熱帶香料飲料作物工程技術(shù)研究中心,海南萬(wàn)寧 571533)

香草蘭,又名香莢蘭,多年生、半附生多汁草本植物,喜炎熱潮濕氣候[1-2]。公元1500年,墨西哥土著居民將其用于飲品增香,后被西班牙人傳入歐洲,十九世紀(jì)傳入亞洲和非洲等熱帶、亞熱帶地區(qū)[3-4]。香草蘭鮮莢經(jīng)過發(fā)酵(包括殺青、發(fā)汗、干燥、陳化)過程,產(chǎn)生獨(dú)特的芳香氣味。目前在不同產(chǎn)地、不同品種的香草蘭豆莢中的所鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)已超過460種,包括醛類、酚類、芳香酯、脂肪酸、酮類等[5-8]。其中醛類如香草醛、對(duì)羥基苯甲醛等物質(zhì)含量較高,對(duì)香味的貢獻(xiàn)也較大,但香草蘭豆莢濃郁獨(dú)特的香氣并非由這兩種物質(zhì)決定,一些含量低的物質(zhì)對(duì)香草蘭的整體香氣也有重要的影響[9]。Pe’rez-Silva等[10]通過GC-olfactometry(GC-O)在成品香草蘭豆莢中檢測(cè)到了26種香氣活性成分,其中21種物質(zhì)的含量低于20 mg/kg。在之前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),將不同階段的香草蘭豆莢中香蘭素補(bǔ)償?shù)酵凰胶筮M(jìn)行電子鼻和電子舌分析,結(jié)果顯示幾種豆莢的風(fēng)味不同[11]。因此,進(jìn)行香草蘭發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的定量分析,有助于對(duì)影響香草蘭香氣的關(guān)鍵因素的研究。

在對(duì)揮發(fā)性成分的鑒定分析研究中,主要有頂空固相微萃(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)、溶劑萃取及同時(shí)蒸餾萃取(simultaneous distillation extraction,SDE)等方法,結(jié)合GC-MS進(jìn)行[10,12-17]。Tomislav等[14]采用HS-SPME-GC-MS方法應(yīng)用于香草蘭揮發(fā)性成分的提取鑒定,并對(duì)萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化;Sabik Hassan等[15]采用不同的固相微萃取頭提取,研究得出可用于香草蘭揮發(fā)性成分半定量的HS-SPME-GC-MS方法,并鑒定出81種揮發(fā)性成分。Pe’rez-Silva等[10]分析比較了不同溶劑提取的香草蘭豆莢香氣成分,發(fā)現(xiàn)以戊烷和乙醚的混合溶液提取效果最佳,GC-MS和GC-olfactometry(GC-O)分析鑒定出65種香氣成分。Zhang等[16]以二氯甲烷為溶劑提取香草蘭豆莢,鑒定出78種香氣成分。Brunschwig等[17]采用微型同時(shí)蒸餾萃取法對(duì)三個(gè)不同品種的香草蘭豆莢中揮發(fā)性成分進(jìn)行提取,鑒定出38種揮發(fā)性成分。SPME方法具有快速、穩(wěn)定、無需溶劑等優(yōu)點(diǎn),對(duì)痕量物質(zhì)的鑒定穩(wěn)定,此外由于香草蘭豆莢香氣成分復(fù)雜,萃取頭難以較徹底的提取。SDE具有節(jié)省溶劑、回收率高等優(yōu)點(diǎn),但此方法操作溫度較高,揮發(fā)性成分損失較大。

因此,本文戊烷和乙醚為混合溶劑提取,提取前采用液氮對(duì)樣品進(jìn)行速凍,并用冰浴保持提取過程中的低溫環(huán)境,來減少揮發(fā)性成分的損失。內(nèi)標(biāo)法結(jié)合GC-MS對(duì)香草蘭發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的含量進(jìn)行定量分析,確定香氣成分的富集過程。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香草蘭豆莢 11月份采收于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所香草蘭種植基地,長(zhǎng)約9～15 cm,呈兩側(cè)彎曲的圓柱形,豆莢飽滿;C8～C30正構(gòu)烷烴(標(biāo)準(zhǔn)品) 美國(guó)o2si公司;正己醇(分析標(biāo)準(zhǔn)品) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所有提取用有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Aglient-7890A/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;WD-12氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司;FJ200-S高速均質(zhì)分散機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;18ND真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技控股有限公司;LRH-250F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香草蘭豆莢的發(fā)酵 豆莢加工方法為單元式熱空氣發(fā)酵法[18-19]。取約500 g完好的香草蘭鮮豆莢(Fresh vanilla beans,FVB)放于70 ℃水浴中3～5 min進(jìn)行殺青,瀝干表面水分后以干凈的毛巾包裹,取樣標(biāo)記為殺青豆莢(Blanched vanilla beans,BVB)。每天放在55 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)汗5 h,重復(fù)發(fā)汗5 d,得到發(fā)汗豆莢(Sweated vanilla beans,SVB)。收取黑褐色、柔軟的豆莢放在晾干架上晾干,直至豆莢水分含量降低到30%左右,干燥結(jié)束,取樣并標(biāo)記為干燥豆莢(Dried vanilla beans,DVB)。將干燥好的豆莢真空包裝,放在陰涼干燥處陳化約6個(gè)月,豆莢發(fā)酵完成,得到陳化豆莢(Cured vanilla beans,CVB)。取上述5個(gè)階段的豆莢進(jìn)行真空冷凍干燥,干燥后的豆莢在液氮的保護(hù)下研磨成粉,于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 揮發(fā)性成分的提取 根據(jù)Pe’rez-Silva[10]等的方法調(diào)整后進(jìn)行:分別稱取1.2.1中得到的豆莢粉于150 mL圓底燒瓶中,在圓底燒瓶中加入10 mL超純水、80 mL乙醚-正戊烷(1∶1,v/v)混合溶劑,準(zhǔn)確加入82 μg的正己醇作為內(nèi)標(biāo)。在冰浴條件下用高速均質(zhì)分散機(jī)攪拌10 min混勻,取上層有機(jī)層加入無水硫酸鈉除水后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30 ℃下濃縮至約10 mL,再以氮吹儀濃縮至1 mL,過0.22 μm濾膜進(jìn)行GC-MS分析。分析前待測(cè)樣品儲(chǔ)藏于-20 ℃冰箱,每個(gè)樣品重復(fù)提取兩次。

1.2.3 GC-MS分析 安捷倫7890A氣相色譜儀結(jié)合安捷倫5975c四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。方法A[10]:以DB-Wax熔融石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)為分離柱,載氣(He)流速1 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,電子沖擊能量70 eV。離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,進(jìn)樣器及檢測(cè)器溫度為250 ℃。升溫程序:40 ℃保持3 min,然后以3 ℃/min升溫至245 ℃,保持5 min。質(zhì)量掃描范圍m/z 40～600。方法B[20]:以DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 mm)為分離柱,載氣(He)流速1 mL/min,進(jìn)樣量為1 μL,離子源溫度230 ℃,接口溫度280 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃。升溫程序:40 ℃保持2 min,以1.5 ℃/min升溫至65 ℃,保持2 min,以0.5 ℃/min升溫至70 ℃,再以5 ℃/mi 升溫到90 ℃,再以3 ℃/min升溫至170 ℃,最后以4 ℃/min升溫到280 ℃并保持2 min。質(zhì)量掃描范圍m/z 30～300。兩種方法均為不分流進(jìn)樣。

1.2.4 定性定量分析 定性:分別以兩種色譜柱為分離柱進(jìn)C8～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品,其他條件與進(jìn)樣品的條件保持一致。經(jīng)儀器配置的NIST 14譜庫(kù)檢索,再計(jì)算保留指數(shù)(retention index,RI)并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)對(duì)比進(jìn)行定性。根據(jù)各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的對(duì)比進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

保留指數(shù)(RI)=100(N-1)+[lg(tN+1)-lgtN]/[lg(tN+1)- lg(tN-1)]×100

式中:N為待定性組分的碳原子數(shù);N-1和N+1分別為待定性組分保留時(shí)間前后的正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；t為保留時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法鑒定結(jié)果比較分析

以DB-5毛細(xì)管柱為分離柱,氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)出45種揮發(fā)性成分,其中鮮豆莢(FVB)、殺青豆莢(BVB)、發(fā)汗豆莢(SVB)、干燥豆莢(DVB)及陳化豆莢(CVB)分別有19、17、25、33、37種揮發(fā)性成分。以DB-Wax毛細(xì)管柱為分離柱,氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)出53種物質(zhì),發(fā)酵不同階段的五種豆莢中分別含有20、21、27、38、46種揮發(fā)性成分。兩種方法共分離檢測(cè)出69種物質(zhì)。對(duì)比表1和表2可以看出,DB-Wax對(duì)大分子脂肪酸的分離優(yōu)于DB-5,而DB-5對(duì)碳原子數(shù)低于20的烷烴的分離及定量更好。1-十九碳烯和1-十八碳烯2種烯烴及四甲基吡嗪、癸烷、十四烷、2,4-二叔丁基苯酚、異香蘭素乙酮、8-甲基十七烷、2-甲氧基-4-丙基苯酚、4-羥基-3-甲氧基丁酰苯、丁基異丁基鄰苯二甲酸酯、(S)(+)-Z-13-甲基-11-十五碳烯-1-醇乙酸酯共12種物質(zhì)在發(fā)酵后豆莢(CVB)中被檢測(cè)到,在其他相關(guān)研究中未見報(bào)道。

2.2 醛類物質(zhì)分析

如表1和表2所示,反式-2-癸烯醛(33.52 mg/kg)只在發(fā)汗后的豆莢中出現(xiàn),該結(jié)果在Pe’rez-Silva等[21]研究中也有出現(xiàn),并推斷其為脂肪酸的氧化而得,而高溫可以促進(jìn)脂肪酸的氧化,這可能是在發(fā)汗階段產(chǎn)生反式-2-癸烯醛的一個(gè)原因,殺青階段未檢測(cè)到可能與水分活度有關(guān),發(fā)酵后期可能受存儲(chǔ)及發(fā)酵條件的影響而無法再檢測(cè)到。香草醛、對(duì)羥基苯甲醛也被檢測(cè)到,如表1和表2所示,香蘭素和對(duì)羥基苯甲醛在發(fā)酵過程中逐漸累積,且在發(fā)汗階段產(chǎn)生量較多。以DB-5為分離柱得到陳化豆莢中香蘭素含量為15067.56 mg/kg,約為1.5%,而以DB-Wax為分離柱檢測(cè)到的陳化豆莢香蘭素含量為8131.45 mg/kg,約為0.8%?？梢园l(fā)現(xiàn),DB-5對(duì)香蘭素的分離能力較強(qiáng)。但其他以有機(jī)溶劑提取并通過HPLC定量的研究中香蘭素含量多為2%～3%[10,19],可能受提取溶劑中水影響,使香蘭素提取率降低。

2.3 酚類物質(zhì)分析

DB-5和DB-Wax分別分離出6種和7種酚類物質(zhì),兩種色譜柱對(duì)豆莢中酚類物質(zhì)的分離效果相當(dāng)(表1和表2)。根據(jù)Sharp等[22]、Brunschwig等[23]的報(bào)道,愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、對(duì)甲酚等酚類物質(zhì)是V.planifolia和V.tahitensis兩種香草蘭起源的生物標(biāo)志,因此酚類物質(zhì)含量應(yīng)該成為衡量香草蘭豆莢質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。與Brunschwig等[17]研究的幾種香草蘭豆莢比,本實(shí)驗(yàn)中的陳化豆莢所含苯酚含量(33.26 mg/kg)明顯偏低(表2),4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量(20.30 mg/kg)與Parahurahu相近,愈創(chuàng)木酚含量(417.25 mg/kg)與幾種豆莢均不相同。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,酚類物質(zhì)主要在干燥及陳化階段產(chǎn)生,這兩個(gè)階段受氣候條件影響較大[24],降雨量的增加會(huì)延長(zhǎng)干燥時(shí)間導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的揮發(fā),同時(shí)也可能導(dǎo)致霉菌的產(chǎn)生,影響豆莢菌群結(jié)構(gòu)而影響發(fā)酵。

2.4 醇類物質(zhì)分析

根據(jù)表1和表2的結(jié)果,以DB-5為分離柱共檢測(cè)到2種醇類,而DB-Wax檢測(cè)到8種醇類,可以得出,DB-Wax色譜柱對(duì)醇類物質(zhì)的分離能力較強(qiáng)。如表2所示,在陳化豆莢中含量較高的醇是香蘭醇,發(fā)汗階段開始產(chǎn)生,干燥階段含量明顯增加,在陳化階段含量下降,根據(jù)Palama等[25]的報(bào)道,香蘭醇苷在發(fā)酵3～5個(gè)月內(nèi)含量不變,5個(gè)月后含量增加,因此香蘭醇不完全來自于糖苷的轉(zhuǎn)化,還存在其他方式,而陳化階段的含量下降可能是由于揮發(fā)損失或與糖苷的轉(zhuǎn)化[1]。Pe’rez-Silva等[10]、Brunschwig等[17]通過GC-O分析香草蘭發(fā)酵豆莢的結(jié)果顯示,醇類物質(zhì)中茴香醇、苯乙醇香味強(qiáng)度較高。其中茴香醇被發(fā)現(xiàn)呈八角味、甜香味,表2以DB-Wax檢測(cè)到的茴香醇結(jié)果顯示在鮮豆莢干基中含量為19.76 mg/kg,在之前的研究中發(fā)現(xiàn)鮮豆莢也有微弱的甜香味及花香味[11],茴香醇可能是其來源。殺青過程未檢測(cè)到茴香醇,在發(fā)汗過程重新又檢測(cè)到,表明在發(fā)汗過程中發(fā)生了茴香醇的生成反應(yīng),在干燥和陳化過程中含量逐漸增加。苯乙醇僅在陳化后的豆莢中檢測(cè)到,呈花香味[17]。在Dignum等[9]對(duì)香草蘭中葡萄糖苷酶的研究中發(fā)現(xiàn),苯乙醇的糖苷并不是該酶的底物,生成方式還有待進(jìn)一步研究。醇類物質(zhì)的生成可能與醛、酮類物質(zhì)催化氫化有關(guān)。

2.5 酮類物質(zhì)分析

如表1和表2所示,兩種色譜柱對(duì)酮類物質(zhì)的分離能力相當(dāng)。在香草蘭豆莢的揮發(fā)性成分中,酮類物質(zhì)報(bào)道較多的是香蘭素乙酮,呈甜香味、蜂蜜味、香草蘭味[10,15]。在以DB-5和DB-Wax為分離柱的檢測(cè)結(jié)果中均未出現(xiàn)香蘭素乙酮,但出現(xiàn)了同分異構(gòu)體異香蘭素乙酮,目前還未出現(xiàn)對(duì)該物質(zhì)的報(bào)道,其生成途徑和氣味特性有待研究。Pe’rez-Silva等[21]的研究中,3-羥基2-丁酮的產(chǎn)生可能與一種桿菌如枯草芽孢桿菌有關(guān),并且在發(fā)酵過程中含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)中,3-羥基-2-丁酮在干燥階段開始產(chǎn)生,且含量增加,陳化豆莢中達(dá)到566.50 mg/kg(干重),而在Brunschwig等[23]的研究中,五種香草蘭品種中含量最高的達(dá)到951 mg/kg(干重),考慮香草蘭品種不同的影響。Pe’rez-Silva等[10]以正戊烷和二氯甲烷為混合溶劑提取出的1-辛烯-3-酮,在本文中的兩種方法均未檢測(cè)到,可以排除分離柱極性的原因。

表2 以DB-Wax為分離柱檢測(cè)到的香草蘭發(fā)酵不同階段的揮發(fā)性成分Table 2 Aroma compounds identified in vanilla beans in different curing stages by DB-Wax

續(xù)表

表1 以DB-5為分離柱檢測(cè)到的香草蘭發(fā)酵不同階段的揮發(fā)性成分Table 1 Aroma compounds identified in vanilla beans in different curing stages by DB-5

續(xù)表

2.6 酸類物質(zhì)分析

對(duì)比表1和表2的酸類物質(zhì)可以發(fā)現(xiàn),DB-Wax對(duì)酸類物質(zhì)的分離能力更強(qiáng),共檢測(cè)到9種。脂肪酸的氧化是香草蘭豆莢中非常重要的生香反應(yīng),如上面提到的醛類及其他小分子酸、醇等。根據(jù)表1和表2的結(jié)果,豆莢中酸類物質(zhì)的含量處于較高的水平,如乙酸、十六酸及亞油酸?？梢钥闯?亞油酸在干燥過程以后含量降低,氧化生成以反式-2-癸烯醛為代表的二烯醛類物質(zhì)可能是其降低的原因[21]。3-甲基丁酸等被報(bào)道可以產(chǎn)生花香味、甜香味的物質(zhì)[10,23],在陳化豆莢中均被檢測(cè)到。

2.7 其他物質(zhì)分析

與發(fā)酵后的豆莢(CVB)對(duì)比,發(fā)酵前期的豆莢中出現(xiàn)了一些物質(zhì),隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行含量逐漸下降最終消失,如2-乙基己基乙酸酯(表2)、己二酸二(2-乙基己)酯(表1)。另有一些物質(zhì)僅出現(xiàn)在了發(fā)酵過程中的某個(gè)階段,如反式肉桂醛、硬脂酸甲酯等。烷烴類物質(zhì)在整個(gè)發(fā)酵過程含量變化不大,且多為大分子烷烴,沸點(diǎn)高。因此可以推斷其對(duì)香氣的貢獻(xiàn)不大。

3 結(jié)論

DB-5與DB-Wax兩種色譜柱對(duì)香草蘭豆莢中揮發(fā)性成分的檢測(cè)有互補(bǔ)作用。兩種分離柱共檢測(cè)到69種揮發(fā)性成分,它們至少出現(xiàn)在香草蘭發(fā)酵過程中的一個(gè)階段。在香草蘭豆莢發(fā)酵的過程中,發(fā)汗階段開始產(chǎn)生揮發(fā)性成分,干燥階段和陳化階段為揮發(fā)性成分的主要產(chǎn)生和累積階段,生香反應(yīng)在這兩個(gè)階段緩慢進(jìn)行,氧化反應(yīng)是香草蘭豆莢中非常重要的生香途徑,受氧氣、水分活度等影響,氧化反應(yīng)的速率大大降低,使得豆莢需要較長(zhǎng)的干燥和陳化期累積香氣成分,而長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵也會(huì)造成揮發(fā)性成分的少量損失。但這并不能解釋一些沸點(diǎn)高的物質(zhì)含量的降低,如亞油酸、大分子烷烴等。因此在發(fā)酵后期,可能存在揮發(fā)性成分間的相互作用或者分解,具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。