唐瑩瑩， 喬玉寶， 蔣志偉， 張 靜， 張若男，田曉清，馬麗艷， 張曉玲， 陸亞男， 樊成奇， 楊 橋

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090； 2. 上海海洋大學(xué)，上海 201306； 3. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022； 4. 舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江舟山 316021； 5. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江哈爾濱 150076)

赤潮(harmful algal blooms， HABs)是全球性的重大環(huán)境問題與生態(tài)災(zāi)害[1]，其不僅嚴(yán)重破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡、危害海產(chǎn)品質(zhì)量安全，其引發(fā)的赤潮毒素經(jīng)食物鏈傳遞還嚴(yán)重威脅人類健康與生命安全[2]。麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning，PSP)是一種代表性赤潮毒素，其分布廣、毒性強、對人類生命健康威脅大[3]。但PSP來源問題仍懸而未決：PSP是由甲藻單獨產(chǎn)生，還是由其共附生菌單獨產(chǎn)生，或由藻菌兩者相互作用共同產(chǎn)生，尚無定論[3-7]。藻菌相互作用關(guān)系(algae-bacterial interaction)是揭示PSP產(chǎn)生機制的關(guān)鍵，而甲藻共附生菌群多樣性信息的解析是闡釋藻菌相互作用關(guān)系的必要前提，但目前此方面研究尚無明確定論[6-11]。

鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumcatenella)是一種全球性的典型赤潮甲藻[4]，目前對其共附生菌群多樣性研究鮮有報道。本文利用高通量測序及微生物純培養(yǎng)技術(shù)，解析了東海鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群的物種種類及相對豐度信息，并分離獲得其可培養(yǎng)微生物菌株，以期為后續(xù)解析藻菌相互作用關(guān)系提供必須的微生物菌株及生物背景信息資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鏈狀亞歷山大藻(AlexandriumcatenellaLZ1706)分離自東海舟山海域。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻培養(yǎng)

藻培養(yǎng)使用f/2培養(yǎng)基。首先用超純水配制75.0 g·L-1NaNO3溶液、5.0 g·L-1NaH2PO4·H2O、L1 Trace Metal Solution滅菌后備用，再用高溫滅菌后的超純水配制Vitamin Solution作為儲備液。f/2培養(yǎng)基配制過程如下：用超純水將鹽鹵稀釋至鹽度為25‰，按照表1用量加入除Vitamin Solution以外各儲備液，115 ℃高溫滅菌30 min，冷卻至室溫后加入Vitamin Solution。藻培養(yǎng)條件為光照強度：4 500～5 000 lx，光照周期：12L/12D，培養(yǎng)溫度：25 ℃。

1.2.2 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

待藻細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取50 mL藻液于6 000 r·min-1離心收集藻細(xì)胞，使用50 mL PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌細(xì)胞沉淀3次后備用[10-11]。

使用 Stool DNA Kit 試劑盒(美國OMEGA)提取藻樣共附生菌總基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書進行[6-9]。PCR擴增反應(yīng)使用細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)通用擴增引物338F及806R。引物序列分別為上游引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′、下游引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR擴增反應(yīng)體系如下：5×FastPfu 緩沖液：4 μL，2.5 mM dNTPs：2 μL，上游引物(5 μM)：0.8 μL，下游引物(5 μM)：0.8 μL，DNA多聚酶：0.4 μL，BSA：0.2 μL，模板DNA：10 ng，補去離子水至總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共27個循環(huán)，最后72 ℃下作用10 min進行延伸。使用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，使用AXYGEN DNA凝膠回收試劑盒(AP-GX-50)切膠回收PCR產(chǎn)物。

數(shù)據(jù)質(zhì)控：回收后的PCR產(chǎn)物樣品送樣進行Illumina Miseq高通量測序(上海美吉生物公司)。數(shù)據(jù)質(zhì)控參照文獻[6-9]進行：根據(jù)PE讀長之間相互重疊關(guān)系進行序列拼接，同時對讀長質(zhì)量和拼接效果進行質(zhì)控分析。過濾讀長尾端質(zhì)量值小于20的堿基；最小重疊長度：10 bp；拼接序列的重疊區(qū)所允許的最大錯配比率：0.2；根據(jù)序列兩端DNA條形碼及引物進行樣品區(qū)分；使用軟件：FLASH及Trimmomatic，應(yīng)用FLASH軟件制作矢量圖，應(yīng)用Trimmomatic軟件處理Illumina測序數(shù)據(jù)中一些質(zhì)量低或者帶有adapters序列的raw reads。

數(shù)據(jù)分析：對獲得的非重復(fù)序列進行(operational taxonomic units，OTU)聚類分析以獲得OTU代表序列，從中選取與代表序列相似度大于97%的序列產(chǎn)生OUT數(shù)據(jù)表。通過貝葉斯分類算法(ribosomal database project，RDP)對OUT數(shù)據(jù)表進行分類學(xué)分析，分別在不同分類水平上進行樣本群落組成統(tǒng)計分析[6-8]。選取Silva、RDP、Greengene為細(xì)菌16S比對數(shù)據(jù)庫，使用Qiime平臺與 RDP Classifier分別作為計算軟件及算法，設(shè)定0.7為置信度閾值。群落豐富度指數(shù)(community richness)采用Chao指數(shù)和ACE指數(shù)；群落多樣性指數(shù)(community diversity)采用Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)。利用不同測序深度時微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建測序樣品的稀釋曲線(rarefaction curve)[9]。

1.2.3 可培養(yǎng)共附生菌株的分離及鑒定

取對數(shù)生長期藻液1 mL，于6 000 r·min-1離心收集藻細(xì)胞，用無菌水重懸細(xì)胞沉淀，冰浴下對藻細(xì)胞進行超聲波處理5 min，加入2 mL無菌水重懸，對重懸液進行10倍梯度稀釋后，取100 μL稀釋液均勻涂布于2216E培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，待平板上生長出單菌落后，挑取單菌落進行進一步劃線純化后，挑取單菌落至固體斜面，置4 ℃進行菌株保存[10-11]。

16S rRNA測序及比對：將菌株斜面培養(yǎng)物接種到5 mL Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中，置搖床28 ℃培養(yǎng)36 h，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(美國Sigma)提取基因組DNA。16S rRNA基因PCR擴增通用引物27F及1492R，其序列分別為上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492R：5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系包括：2×TaqPCR MasterMix：25 μL，上/下游引物：各1 μL，模板DNA：3 μL，無菌水：20 μL。PCR擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。送樣至上海美吉生物進行基因測序，分析獲得的16S rRNA基因序列通過GenBank及BLAST 軟件進行序列同源性對比，使用MEGA軟件(7.0)構(gòu)建菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)篩選

鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群的測序結(jié)果如表1所示，高通量測序共獲得36 727條序列，長度分布在363～493。 441～460范圍內(nèi)的序列數(shù)量最多，為22 024條，其次是421～440范圍，為14 700條。樣品的Shannon-Wiener曲線(圖1)表明本次所測樣品的測序數(shù)據(jù)量合理，足以反映樣品中的物種多樣性。樣品的生物多樣性指數(shù)(alpha-diversity)統(tǒng)計分析結(jié)果(表1)表明，所測樣品的微生物群落多樣性較高。

2.2 鏈狀亞歷山大藻的共附生菌多樣性分析

MiSeq高通量測序結(jié)果表明，鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群包含43個OUT，包括6門，10綱，19目，25科及34屬。其中優(yōu)勢門(>5%)3個，包括變形菌門(Proteobacteria，53.9%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，27.5%)及藍(lán)藻門(Cyanobacteria，16.8%)；優(yōu)勢綱(>5%)4個，包括γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria，28.4%)、黃桿菌綱(Flavobacteriia，24.3%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria，21.4%)、藍(lán)藻綱(Cyanobacteria，16.8%)(圖2)；優(yōu)勢屬(>5%)5個，包括Cryomorphaceae科下未知屬(22.8%)、Cyanobacteria綱下未知屬(16.8%)、Saccharospirillum屬(14.6%)、紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)下未分類屬(7.9%)及Maricaulis屬(5.6%)。

圖1 鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群高通量測序樣品Shannon-Wiener 曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve of the sequencing sample from A. catenella (LZ1706)

數(shù)據(jù)名稱 Item數(shù)值 Value基本數(shù)據(jù)(優(yōu)化后) 序列數(shù)36727 堿基數(shù)16118044 平均長度438 最短長度363 最長長度493數(shù)據(jù)名稱 Item數(shù)值 Value生物多樣性數(shù)據(jù) OTU43 Shannon指數(shù)2.599 Simpson指數(shù)0.117 Ace指數(shù)43 Chao指數(shù)43

圖2 基于OTU的鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the bacterial community associated with A. catenella LZ1706 based on OTU

圖3 鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群屬水平的相對豐度分布圖Fig.3 Relative abundance at genus level of the bacterial community associated with A. catenella LZ1706

2.3 鏈狀亞歷山大藻可培養(yǎng)共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育進化分析

從鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)培養(yǎng)物中分離獲得可培養(yǎng)微生物菌株12株，其16S rRNA基因序列測序及系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，這些菌株屬于9個屬，包括Marinobactersp.(2株)、Ponticoccussp. (2株)及Mameliellasp.、Pseudooceanicolasp.、Marivitasp.、Limnobactersp.、Saccharospirillumsp.、Maricaulissp.、Halieasp.、Maritimibactersp.各1株。其16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示，其中菌株LZ-27與LZ-7與已知菌株的16S rRNA基因同源性最高值分別為96.0%及97.7%，表明其分別為Ponticoccus屬及Pseudooceanicola屬潛在新種，其多相分類學(xué)鑒定分析目前正在進行中。

圖4 鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)可培養(yǎng)菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of the cultivable bacterial strains and related taxa

3 討論

藻菌相互作用關(guān)系是揭示PSP產(chǎn)生機制的關(guān)鍵，可為赤潮的防治提供科學(xué)參考[12-16]。免培養(yǎng)(culture-independent)Illumina MiSeq高通量測序分析可解析復(fù)雜共生體系中環(huán)境微生物群落多樣性信息，從而為優(yōu)化甲藻共附生菌的分離并提高其可培養(yǎng)性提供有益參考[5,8-11]。本文利用MiSeq高通量測序首次對東海鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群多樣性進行了分析。從獲得的43個OTU中歸類出34個屬，其優(yōu)勢屬5個，其中糖螺菌屬(Saccharospirillum)及Maricaulis屬為首次在亞歷山大藻中發(fā)現(xiàn)。此外，其未知屬共附生菌群比例高達(dá)50.6%。表明鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)蘊含潛在的海洋新種屬微生物及發(fā)掘其未知生物學(xué)功能的潛力，值得進一步深入挖掘。

此外，基于微生物純培養(yǎng)技術(shù)從鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)中分離獲得包括2株潛在新種在內(nèi)的12株可培養(yǎng)菌株，但此數(shù)量遠(yuǎn)低于MiSeq高通量測序分析所呈現(xiàn)的藻共附生菌群的豐富多樣性。表明海洋復(fù)雜共生體系內(nèi)共附生菌群的低可培養(yǎng)性(cultivability)仍是海洋微生物研究領(lǐng)域的一個關(guān)鍵瓶頸，今后在提高赤潮藻共附生菌選擇性分離方面的研究仍須繼續(xù)加強。

4 小結(jié)

東海產(chǎn)PSP典型赤潮甲藻-鏈狀亞歷山大藻(LZ1706)共附生菌群種優(yōu)勢屬有5個，包括Cryomorphaceae科未知屬、Cyanobacteria綱未知屬、紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)未知屬、糖螺菌屬(Saccharospirillum)及Maricaulis屬。未知類群比例較高，其中蘊含潛在的新種屬微生物。