ZP-20f對(duì)口腔鱗癌的抑制作用及機(jī)制研究

孫學(xué)麗，曹鐘義

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，江西 南昌 330000

以口腔上皮鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）為主的口腔癌是常見(jiàn)的腫瘤之一，2015年中國(guó)新增病例約48 100例，死亡約22 100例［1］。雖然近年來(lái)手術(shù)、化療和放療等治療手段發(fā)展迅速，但效果不甚滿(mǎn)意，患者5年生存率約60%［2］?；煹挚埂⒉涣挤磻?yīng)及腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移使得現(xiàn)有化療藥物遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足臨床需求。因此，針對(duì)OSCC，開(kāi)發(fā)效果顯著、不良反應(yīng)輕微的新型治療藥物，是藥物研發(fā)領(lǐng)域的重點(diǎn)。

微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成的異二聚體，是細(xì)胞骨架的重要組成部分［3］。微管蛋白與微管之間聚集-解聚的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫娑季哂惺种匾淖饔茫?-5］，已成為抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的重要靶點(diǎn)之一，如臨床上常用的抗腫瘤藥物紫杉醇能抑制微管解聚成微管蛋白，長(zhǎng)春新堿則能抑制微管蛋白聚集形成微管。

化合物ZP-20f（圖1）是一種結(jié)構(gòu)新穎的新型二芳基-β-內(nèi)酰胺類(lèi)化合物，可以抑制微管蛋白聚集形成微管，從而抑制細(xì)胞有絲分裂，體外、體內(nèi)研究表明，其對(duì)卵巢癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有較好的抑制作用［6］。為了研究ZP-20f對(duì)OSCC的抗腫瘤作用，拓展其抗腫瘤譜，本文在體外研究了該化合物對(duì)OSCC細(xì)胞系CAL-27、SCC-9增殖的抑制作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CAL-27、SCC-9購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司，ZP-20f由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院王洋教授惠贈(zèng)，DMEM培養(yǎng)基、雙抗和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GE公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GENIMI公司，細(xì)胞凋亡及周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人舌癌細(xì)胞株CAL-27和SCC-9于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的條件下，在含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至約85%匯合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 四甲基偶氮唑鹽實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，按4×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的受試樣品繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/L的四甲基偶氮唑鹽溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，再加入150 μL/孔DMSO，振蕩溶解15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm時(shí)各孔吸光度（D）。每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)算受試樣品的IC50。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，按5×105個(gè)/皿接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的受試樣品，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集各皿中貼壁細(xì)胞，75%乙醇固定后，加入RNase和碘化丙啶（propidium iodide，PI）充分混勻后，室溫避光溫育20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，按5×105個(gè)/皿接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的受試樣品，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌后，用結(jié)合液重懸，分別加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染色，室溫避光溫育20 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，充分吹打成單個(gè)細(xì)胞，以1 500個(gè)/皿接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的受試樣品培養(yǎng)48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，棄去培養(yǎng)基用無(wú)水甲醇固定，結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)受試樣品處理后，胰蛋白酶消化，離心收集沉淀，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度后，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，一抗二抗溫育后，采用ECL顯影液曝光。

2 結(jié) 果

2.1 化合物ZP-20f顯著抑制OSCC細(xì)胞增殖

化合物ZP-20f對(duì)OSCC細(xì)胞株SCC-9和CAL-27的增殖具有較好的體外抑制作用，具有濃度依賴(lài)性，IC50分別達(dá)到7.66和9.62 nmol/L（表1），與陽(yáng)性對(duì)照藥物CA-4活性相當(dāng)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，化合物ZP-20f對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的克隆形成具有顯著的抑制作用（圖2）。

表 1 化合物ZP-20f、CA-4抑制OSCC細(xì)胞SCC-9和CAL-27增殖的IC50Tab. 1 The IC50 values of ZP-20f, CA-4 against SCC-9 and CAL-27

圖 2 化合物ZP-20f抑制OSCC細(xì)胞SCC-9和CAL-27集落的形成并具有濃度依賴(lài)性Fig. 2 Compound ZP-20f inhibited SCC-9 and CAL-27 colony formation in a dose-dependent manner

2.2 ZP-20f可在G2/M期阻滯細(xì)胞周期

為研究ZP-20f對(duì)OSCC細(xì)胞周期的影響，我們用受試樣品處理細(xì)胞后，進(jìn)行PI染色，并采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞中DNA含量，結(jié)果表明，ZP-20f可以顯著誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯，受試化合物濃度的增加，G2/M期細(xì)胞比例隨之增加，呈濃度依賴(lài)性（圖3）。

2.3 ZP-20f可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

作用于微管-微管蛋白的抗腫瘤藥物主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。為檢測(cè)ZP-20f誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，我們用受試樣品處理細(xì)胞后，采用PI-Annexin V雙染色法染色后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，ZP-20f可以顯著誘導(dǎo)CAL-27和SCC-9細(xì)胞株凋亡，且具有濃度依賴(lài)性（圖4）。

2.4 ZP-20f調(diào)控細(xì)胞周期凋亡相關(guān)蛋白變化

為進(jìn)一步研究ZP-20f抗腫瘤作用機(jī)制，我們采用Western blot檢測(cè)了細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的變化情況。結(jié)果顯示，ZP-20f濃度依賴(lài)的誘導(dǎo)組蛋白3（histone 3）磷酸化的上調(diào)、cyclin B1表達(dá)的上調(diào)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］的切割，且具有濃度依賴(lài)性（圖5）。

圖 3 ZP-20f誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞SCC-9和CAL-27細(xì)胞G2/M期阻滯并具有濃度依賴(lài)性Fig. 3 ZP-20f induced SCC-9 and CAL-27 cell cycle arrest at G2/M phase in a dose-dependent manner

圖 4 ZP-20f誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞SCC-9和CAL-27細(xì)胞凋亡并具有濃度依賴(lài)性Fig. 4 ZP-20f induced SCC-9 and CAL-27 cellular apoptosis in a dose-dependent manner

圖 5 ZP-20f調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞SCC-9和CAL-27細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig. 5 ZP-20f regulated SCC-9 and CAL-27 cell cycle and apoptosis-related protein

3 討 論

化療是臨床治療OSCC的主要手段之一，特別是對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移、失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者來(lái)說(shuō)，化療幾乎是唯一的治療手段，臨床研究表明，許多化療藥物可以改善預(yù)后，延長(zhǎng)患者生存期［5，7］。但腫瘤耐藥性的出現(xiàn)和化療藥物引起的不良反應(yīng)使得現(xiàn)有化療藥物遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足臨床需求。由于在細(xì)胞有絲分裂中的重要作用，微管和微管蛋白現(xiàn)已成為研究抗腫瘤化合物的重要作用靶點(diǎn)。微管蛋白與小分子藥物結(jié)合位點(diǎn)有3個(gè)，分別是紫杉醇結(jié)合位點(diǎn)、長(zhǎng)春堿結(jié)合位點(diǎn)和秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)。紫杉醇、埃博霉素等結(jié)合于紫杉醇結(jié)合位點(diǎn)，抑制微管解聚成微管蛋白。長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿結(jié)合于長(zhǎng)春堿結(jié)合位點(diǎn)，抑制微管蛋白聚集形成微管。這兩類(lèi)藥物在臨床上作為抗腫瘤藥物已有廣泛應(yīng)用。作用于秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)尚未有上市的抗腫瘤藥物，CA-4、BNC105等作為抗腫瘤藥物目前正在臨床試驗(yàn)階段。ZP-20f是根據(jù)CA-4結(jié)構(gòu)改造獲得的小分子化合物，與CA-4相比具有水溶性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)。本研究表明，ZP-20f對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞SCC-9和CAL-27具有較強(qiáng)的體外抑制活性，IC50為7～10 nmol/L，與CA-4作用相當(dāng)。與CA-4、紫杉醇等藥物類(lèi)似，ZP-20f可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，主要與其抑制微管形成從而干擾細(xì)胞有絲分裂中紡錘體的形成有關(guān)［8-9］。此外，ZP-20f可以上調(diào)組蛋白3的磷酸化水平和cyclin B1的表達(dá)。研究表明，cyclin B1在細(xì)胞中合成于S期，G2期含量達(dá)到最大值，M期被降解［10］。因此G2/M期細(xì)胞中cyclin B1含量比正常周期的細(xì)胞多。組蛋白3是染色質(zhì)中主要的蛋白組分，組蛋白3的磷酸化是高度保守的，起始于G2期晚期，在染色質(zhì)凝聚時(shí)擴(kuò)散到整個(gè)染色體，在有絲分裂結(jié)束時(shí)發(fā)生脫磷酸化。因此磷酸化的組蛋白3在G2/M期阻滯的細(xì)胞中表達(dá)量較高［11］。此外，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，凋亡核心成員caspase 3被激活，細(xì)胞內(nèi)的PARP被切割成cleaved-PARP而失去酶活力。因此細(xì)胞中cleaved-PARP量增加可以證明細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12］。

綜上所述，本研究表明微管蛋白聚集抑制劑ZP-20f在體外對(duì)OSCC細(xì)胞的增殖具有良好的抑制作用，且具有濃度依賴(lài)性，能阻滯細(xì)胞周期于G2/M，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)這類(lèi)化合物作為治療口腔上皮鱗癌的化療藥物提供了依據(jù)。