侯婧瑛， 凌 輝， 金小巖， 羅 信， 李楚強， 王凌云△

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院 1急診科， 2消化內科， 3綜合科， 廣東 廣州 510120)

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)的表達異常與多種疾病尤其是腫瘤密切相關[1-2]。，其可通過染色體重塑、轉錄和轉錄后加工等不同層面參與基因表達調控[3-4]。微小RNA (microRNA， miRNA，miR)是廣泛存在于真核細胞中的單鏈非編碼RNA，通過與靶基因3’端非翻譯區(qū)近乎完全或不完全互補結合，在轉錄后或翻譯水平發(fā)揮對基因表達的調節(jié)作用。有證據(jù)表明lncRNA與miRNA之間的相互調控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色[5]。有靶向結合位點的lncRNA可以與miRNA形成競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)從而抑制miRNA對靶基因表達的調控[3,6]。

肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是lncRNA 家族的一個重要成員。有證據(jù)顯示MALAT1表達上調促進了胃癌的侵襲、進展及轉移[7]。miR-570-3p則對一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[8]。有研究表明miR-570-3p能夠通過調控與腫瘤免疫相關的靶基因參與影響胃癌的臨床病理進程包括分化、腫瘤侵襲及淋巴結轉移等[9]。在本研究中，我們觀察lncRNA-MALAT1對胃癌細胞增殖的影響并探討其是否通過靶向下調miR-570-3p而發(fā)揮調控作用。

材 料 和 方 法

1 細胞系和試劑

胃癌細胞株SGC7901(中南大學細胞庫)；293T 細胞(中國科學院細胞庫)。DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶(HyClone)；CellTiter 96AQ單溶液細胞增殖檢測試劑盒(Promega)；轉染試劑LipofectamineTMRNAiMAX和Lipofectamine 2000(Invitrogen)；lncRNA-MALAT1 siRNA(si-MALAT1)及其陰性對照(si-MALAT1 negative control,si-MALAT1-NC)、miR-570-3p模擬物(miR-570-3p mimic)和抑制劑(miR-570-3p inhibitor)及陰性對照序列(廣州銳博生物科技有限公司)；QuickMutationTM基因定點突變試劑盒(碧云天)；DpnI酶 (Promega)；psiCHECK-2 雙螢光素酶報告基因載體、螢光素酶檢測試劑盒和Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)。

2 實驗分組和相關序列信息

2.1細胞實驗 將體外培養(yǎng)的人胃癌細胞株SGC7901分為：空白對照(blank control)組：單純的SGC7901細胞株；si-MALAT1組：轉染si-MALAT1；si-MALAT1 NC組：轉染si-MALAT1 NC。具體轉染步驟如下：以每孔5×104的密度接種細胞，充分搖勻。第2天細胞融合度為40%，進行轉染。吸去完全培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，每孔加入1 mL 含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；用RNase-free的去離子水溶解siRNA至終濃度為20 μmol/L，將siRNA溶于500 μL Opti-MEM中，混勻、靜置，為A管；將5 μL LipofectamineTMRNAiMAX 加入500 μL Opti-MEM中，輕輕混勻、靜置，為B管；將A管和B管混合，混勻、靜置20 min，分別加入各孔中；并孵育4～6 h后更換為完全培養(yǎng)基。混勻，放入細胞培養(yǎng)箱；4～6 h后，吸去轉染培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。

2.2螢光素酶報告實驗 設立lncRNA-MALAT1野生型(MALAT1-WT)和突變型(MALAT1-Mut)，其中各型又分為5組：blank control組(單純的293T細胞)、miR-570-3p mimic組、miR-570-3p mimic陰性對照(NC mimic)組、miR-570-3p inhibitor組和miR-570-3p inhibitor陰性對照(NC inhibitor)組。

3 方法

3.1MTS實驗 各組胃癌細胞培養(yǎng)不同時點后消化細胞，吹散細胞并計數(shù)，調整細胞密度至1×105/L再接種到96孔板，每孔100 μL(每孔細胞為1×104)，待細胞貼壁后再收集進行檢測。在各個時點(0、24、48和72 h)收集細胞之后加入CellTiter 96 AQ單溶液細胞增殖檢測試劑(比例10 ∶1，即100 μL培養(yǎng)液中加入10 μL檢測液)，孵育4 h后用Multiscan MK3酶標儀讀板，讀取A490值。

3.2RT-qPCR 檢測 轉染后24 h收集細胞，加入1 mL TRIzol溶液裂解提取總RNA，并采用核酸蛋白分析儀以及1.6%瓊脂糖電泳對提取的總RNA進行分析。取8 μL總RNA液，70 ℃水浴5 min后加入17 μL反轉錄反應液，再在42 ℃孵育60 min終止反應，留取產(chǎn)物后待用。RT-qPCR 擴增參數(shù)： 95 ℃ 10 min(1個循環(huán))； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s(40個循環(huán))；72 ℃延伸10 min。反應結束后，軟件自動計算定量結果，具體引物序列信息詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3.3lncRNA-MALAT1表達載體及其突變載體構建 分析MALAT1基因序列，序列號為NR_002819.4，基因全長8 779 bp。采用RegRNA 2.0預測MALAT1與miR-570-3p的潛在結合位點(集中在第2 000～5 000 bp位置)，由蘇州金唯智公司合成第2 000～5 000 bp片段，并在合成的片段上、下游引入XhoI酶切位點和NotI酶切位點，將合成的片段和psiCHECK-2載體雙酶切，在T4DNA連接酶的作用下，將MALAT1片段構建到psiCHECK-2 載體的多克隆位點處[4]。XhoI酶切位點和NotI酶切位點見表2中下劃線標注部分所示。連接產(chǎn)物轉化后質粒提取并酶切鑒定陽性克隆，送陽性質粒測序(從載體多克隆位點上游載體骨架處測序)。MALAT1突變采用點突變試劑盒，分別點突變4個位點，具體引物序列見表2所示，PCR擴增條件： 94 ℃ 3 min； 98 ℃ 15 s、58 ℃ 15 s、68 ℃ 5 min(20個循環(huán)); 68 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過DpnI酶切，37 ℃消化4 h以去除含甲基化的模板DNA。將經(jīng)過DpnI處理的PCR產(chǎn)物純化回收，測序。測序結果進行BLAST比對確認MALAT1以及MALAT1-Mut已成功克隆至psiCHECK-2載體中，上述野生型和突變型測序引物詳見表3。

3.4陽離子脂質體法進行細胞轉染 雙螢光素酶報告實驗中采用293T細胞進行轉染，細胞培養(yǎng)方法詳見課題組前期參考文獻[4]。轉染前1 d，細胞按每孔2×104的密度接種于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基測定24孔板上。轉染當天，細胞匯合度約為70%～80%，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后每孔加入300 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中；每個孔用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000 1 μL，終體積為50 μL，室溫下靜置5 min；每個孔加入20 μmol/L的miRNA 1 μL或miRNA抑制劑和0.5 μg質粒，再加入Opti-MEM至總體積50 μL，室溫下靜置5 min；(最終孵育液中為50 nmol/L miRNA或100 nmol/L miRNA抑制劑)復合上述2個步驟中的稀釋液，室溫下靜置20 min；每孔加入100 μL轉染復合液，晃動24孔板稍加混勻；在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，用新鮮的完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)替換含有轉染復合物的培養(yǎng)基[4]。

3.5螢光素酶活性檢測 用Dual-Luciferase Reporter Assay System (E1910)進行樣品螢光素酶活性檢測。 轉染48 h后，吸去舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔細胞加入100 μL PLB (Passive Lysis Buffer)，室溫輕微振搖15 min，收集細胞裂解液。將20 μL細胞裂解液加入發(fā)光板后，用GloMax生物發(fā)光檢測儀讀取背景值2 s，每樣品加入100 μL LAR II工作液，快速混勻，讀值2 s。讀值完畢后，每樣品再加入100μL Stop & Glo?Reagent，快速混勻后，放入發(fā)光檢測儀中，讀值2 s。以上每個樣本重復3次，記錄結果和保存數(shù)據(jù)[4]。

表2 引物序列

表3 測序引物序列

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，報告基因分析中多組之間的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MALAT1對胃癌細胞增殖的影響

MTS檢測結果顯示，si-MALAT1組細胞在體外培養(yǎng)24、48和72 h的A490值均低于si-MALAT1 NC組和空白對照組(P<0.01)，見圖1，表明lncRNA-MALAT1能夠促進胃癌細胞的增殖。

Figure 1.Detection of gastric cancer cell proliferation in each group. Mean±SD. n=3.**P <0.01 vs blank control and si-MALAT1 NC group.

2 不同時點miR-570-3p表達量變化情況

檢測單純的SGC7901細胞株培養(yǎng)不同時點miR-570-3p表達量變化情況，結果顯示，隨著時間的推移，miR-570-3p的表達量呈明顯的動態(tài)下降趨勢(P<0.01)，見圖2，提示miR-570-3p的表達與胃癌細胞增殖呈負相關關系。

Figure 2.The miR-570-3p expression in pure SGC7901 gastric cancer cell cultured in vitro at different time points Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 h.

3 lncRNA-MALAT1和miR-570-3p表達的關系

si-MALAT1組lncRNA-MALAT1的表達量較si-MALAT1 NC組和空白對照組明顯降低(P< 0.01);而si-MALAT1組miR-570-3p的表達量較si-MALAT1 NC組和空白對照組明顯升高(P<0.01)，見圖3，表明抑制lncRNA-MALAT1后miR-570-3p表達出現(xiàn)顯著上調。

Figure 3.The MALAT1 and miR-570-3p expression in the gastric cancer cells in each group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs blank control group and si-MALAT1 NC group.

4 psiCHECK-2-MALAT1雙螢光素酶報告基因載體的酶切鑒定和測序

采用RegRNA 2.0分析MALAT1基因序列，確定與miR-570-3p潛在結合位點，見圖4。psiCHECK-2-MALAT1野生型和psiCHECK-2-MALAT1突變型酶切鑒定及測序結果均顯示，目的基因MALAT1和其突變型均已成功轉入psiCHECK-2 載體中，見圖5，其中MALAT1(3 000 bp)在相應的位置切出一條目的條帶(5A箭頭所指)，psiCHECK-2-MALAT1雙螢光素酶報告基因載體構建成功。

Figure 4.Binding sites of miR-570-3p and lncRNA-MALAT1.

Figure 5.Endonuclease digestion and sequencing of the constructed recombinant plasmids. A: the result of enzyme digestion analysis; B and C: the sequencing analysis of the 2 565～2 594 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively; D and E: the sequencing analysis of the 3 040～3 062 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively; F and G: the sequencing analysis of the 3 503～3 524 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively; H and I: the sequencing analysis of the 4 382～4 408 bp of MALAT1 and MALAT1-Mut, respectively.

5 Promega 雙螢光素酶報告基因檢測結果

雙螢光素酶報告基因檢測顯示，miR-570-3p模擬物與MALAT1野生型和突變型報告基因共轉染293T 細胞后，miR-570-3p模擬物組MALAT1野生型的雙螢光素酶活性與miR-570-3p模擬物組陰性對照組相比螢光素酶活性明顯降低(P<0.01)，而miR-570-3p抑制劑組MALAT1野生型雙螢光素酶活性與miR-570-3p抑制劑陰性對照組相比明顯增強(P<0.01)； miR-570-3p模擬物、miR-570-3p抑制劑、miR-570-3p模擬物陰性對照、miR-570-3p抑制劑陰性對照對MALAT1突變型的螢光素酶活性無明顯影響，見圖6。

Figure 6.The results of Promega dual-luciferase reporter assay. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC mimic group; ##P<0.01 vs NC inhibitor group.

討 論

表觀遺傳和非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃避方面起著重要作用[10]。LncRNA是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在不同層面廣泛參與機體多種生物學功能的調控，其中包括對基因表達的遺傳和表觀遺傳調控、基因表達的轉錄水平調控、細胞核亞結構的形成以及對干細胞多能性和體細胞重編程的調控等[3-4]。有證據(jù)表明lncRNA不僅在正常細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮著重要調控作用，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中同樣表現(xiàn)出諸多潛在的作用[1-2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中普遍存在異常的lncRNA表達譜[11]。miRNA在腫瘤領域的研究目前已經(jīng)不斷深入。既往研究表明miRNA參與了多種腫瘤的調控。miRNA 在各種惡性腫瘤中存在表達量上的差異性，其特異性表達調節(jié)了腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡[12]。近年來關于miRNA 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及診斷和治療等方面的相關研究亦不斷涌現(xiàn)?，F(xiàn)已證實lncRNA可作為ceRNA通過miRNA 應答元件(miRNA response element，MRE)競爭結合具有相同MRE 的miRNA來調控靶基因的表達水平，從而影響細胞的功能[3-4]，并且這種調控機制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[5]。

lncRNA-MALAT1首先在非小細胞肺癌被發(fā)現(xiàn)并引起關注。lncRNA-MALAT1定位于染色體11q13.1，在哺乳動物進化中高度保守，核苷酸序列3’ 末端 5 kb 左右人鼠同源性高達90%，提示其在進化過程中扮演了重要角色[13]。多項研究表明lncRNA-MALAT1在胃癌中的表達增高與腫瘤的侵襲、進展及轉移密切相關。LncRNA-MALAT1能夠促進胃癌細胞的擴增[14]，其亦可通過抑制凋亡及上皮間質轉化進而增加胃癌細胞的腫瘤源性和侵襲性[15]；另發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1能夠作用于腫瘤抑制因子進而促進胃癌細胞的遷移和侵襲[16]；此外，lncRNA-MALAT1還通過正向調節(jié)血管形成進而促進胃癌的發(fā)生和轉移[17]；已有學者發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1高表達與胃癌患者的淋巴結轉移、近處轉移以及總體生存率相關[18]。由此可見，lncRNA-MALAT1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移中均扮演著至關重要的角色。在本研究中，與既往報道相一致，我們發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA-MALAT1在胃癌SGC7901細胞株的表達后，細胞不同時點的增殖能力顯著下降，表明lncRNA-MALAT1能夠促進胃癌細胞的增殖。

目前已有報道lncRNA-MALAT1可作為ceRNA參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7,19-20]。miR-570-3p被證實與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，其能夠抑制一些腫瘤的侵襲性并降低惡性腫瘤的死亡風險。miR-570-3p的遺傳突變與膽囊癌的易感性及治療預后相關[21]。研究顯示miR-570-3p能夠抑制慢性粒細胞白血病細胞的擴增和糖代謝[8]，另有報道m(xù)iR-570-3p表達增高能顯著降低直結腸癌的死亡風險[22]。既往已有一些關于miR-570與胃癌的相關研究報道，如miR-570-3p能夠通過下調腫瘤免疫相關因子的表達影響胃癌的臨床病理進程包括分化，腫瘤侵襲性及淋巴結轉移等[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-570-3p與胃腺癌的臨床病理特征包括分化階段、浸潤深度、淋巴結轉移以及TNM分期均相關[23]。在本研究中，為明確lncRNA-MALAT1是否能夠通過靶向下調miR-570-3p參與調控胃癌細胞增殖，我們在體外培養(yǎng)的單純SGC7901胃癌細胞株中檢測了不同時點miR-570-3p表達量的變化情況，結果顯示隨著細胞增殖率的逐漸增加，miR-570-3p表達呈明顯的動態(tài)下降趨勢，提示miR-570-3p的表達與胃癌細胞增殖呈負相關關系。在此基礎上，我們檢測了不同實驗組lncRNA-MALAT1和miR-570-3p的表達情況，結果顯示在采用siRNA抑制lncRNA-MALAT1的表達后，miR-570-3p表達顯著上調，表明lncRNA-MALAT1能夠抑制miR-570-3p的表達。我們進一步通過生物信息學網(wǎng)站RegRNA 2.0數(shù)據(jù)庫預測lncRNA-MALAT1和miR-570-3p的潛在結合位點，在此基礎上構建含MALAT1野生型和突變型質粒的雙螢光素酶報告載體，并用雙螢光素酶報告基因檢測分析MALAT1與miR-570-3p之間的靶向關系。我們發(fā)現(xiàn)，miR-570-3p模擬物組MALAT1野生型報告基因的螢光素酶活性顯著降低，miR-570-3p抑制劑組MALAT1野生型報告基因的螢光素酶活性則明顯增加；而miR-570-3p模擬物、miR-570-3p抑制劑及其陰性對照對MALAT1突變型的螢光素酶活性均無明顯影響。以上充分說明了lncRNA-MALAT1能夠直接靶向結合并下調miR-570-3p。

綜合以上，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1能夠靶向結合并下調miR-570-3p進而促進胃癌細胞增殖。本研究為胃癌的診斷治療以及預后判斷提供了一個新的靶點和突破口。