范雙莉， 任亞麗， 趙志華

(1濟源職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 河南 濟源 459000； 2鄭州大學(xué)， 河南 鄭州 450000)

肺癌是常見的腫瘤死亡原因之一，盡管最近有系統(tǒng)性的改善治療方案，晚期肺癌患者的預(yù)后仍然效果不佳，更有效的治療方式是急需的，免疫治療就是未來治療肺癌的一種途徑[1-2]。已知環(huán)加氧酶2(cyclo-oxygenase 2，COX-2)在肺腺癌和非小細胞肺癌中表達明顯上調(diào)[3]，COX-2的過度表達在肺癌的發(fā)展中起重要作用[4]，COX-2的高水平表達與免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)。COX-2抑制劑可以增加肺癌對放療的敏感性，提高對肺癌的療效[5]。也有實驗通過激動血管緊張素II 1型受體降低COX-2的表達起到治療肺癌的作用。以降低COX-2表達為作用位點的的抗腫瘤藥物可能開辟肺癌治療的新領(lǐng)域。使用軟件預(yù)測抗原區(qū)域[6]，篩選包含優(yōu)勢區(qū)域的長肽，長肽能被專職抗原提呈細胞樹突狀細胞(dendritic cells, DC)有效加工和提呈，在流通的淋巴結(jié)里表位能被持續(xù)的提呈[7]，另外長肽在體內(nèi)降解較慢。為此我們選擇COX-2進行預(yù)測并設(shè)計長肽，進行免疫學(xué)活性實驗，希望能為腫瘤多肽疫苗候選效果更好的長肽。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺腺A549細胞由實驗室常規(guī)保存，采用37 ℃、 5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。T2A2細胞為轉(zhuǎn)染HLA-A*0201分子的TAP缺陷T2細胞系，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)從醫(yī)院血站提供的HLA-A2+健康供者血液分離所得。

2 方法

2.1設(shè)計長肽疫苗 首先對肺癌抗原COX-2進行HLA-A2限制性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)表位肽的預(yù)測，使用生物信息學(xué)預(yù)測軟件NetCTL 1.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)[8]、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)[9]和IEDB(http://tools.iedb.org/main/tcell/)[10]軟件對COX-2氨基酸序列預(yù)測打分。CTL表位限制性MHC類型為HLA-A*02。預(yù)測抗原肽長度為9個氨基酸。目的抗原COX-2的氨基酸序列參照GenBank: AAA58433.1所提供的序列。根據(jù)集中的HLA-A2限制性CTL表位設(shè)計COX-2抗原來源的長肽，共獲得3條長肽，分別為COX-2 P315-338、P355-377和P375-401。

2.2HLA-A2限制性CTL表位肽的合成 候選表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)反相高效液相色譜法分析純化后，其純度大于95%，經(jīng)電噴霧質(zhì)譜法鑒定相對分子質(zhì)量符合理論值。

2.3外周血單個核細胞的分離 準備50 mL離心管，預(yù)先加肝素鈉，預(yù)防血凝。抽取外周血20 mL或40 mL，加入等體積的PBS混勻；將淋巴細胞分離液4 mL加入到15 mL 離心管中，緩慢注入PBS與血液的混合液8 mL；常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，2 000 r/min，離心20 min后，用彎管將上層血清抽掉，再輕輕抽取白膜層；按PBS∶白膜層細胞>5∶1的比例，洗滌白膜層，2 000 r/min離心15 min，得白膜層細胞；用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。

2.4DC的體外誘導(dǎo) 按上述方法分離得到PBMCs，10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)基重懸，計數(shù)2×109/L，按每孔2 mL分至6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；將未黏附的細胞洗脫，抽取液體及未貼壁的細胞，1 000 r/min離心10 min，收集細胞，在6孔板里加入溫?zé)岬腎MDM培養(yǎng)基2 mL，加入IMDM培養(yǎng)基2 mL，并補加粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF; 100 μg/L)和白細胞介素 4(interleukin-4，IL-4； 50 μg/L)；于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； 每2 d半量換液1次，并補加GM-CSF(100 μg/L)和IL-4(50 μg/L)；培養(yǎng)至第5天加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS; 100 μg/L)，誘導(dǎo)DC成熟；48 h 后收集細胞[11]。

2.5DC荷肽實驗 收集成熟的DC，用無血清IMDM培養(yǎng)基充分洗滌，重懸計數(shù)(0.5～1)×109/L；加入長肽20 mg/L，培養(yǎng)4 h；收集細胞，用無血清IMDM培養(yǎng)基洗滌1次；重懸計數(shù)，加入50～100 μg的絲裂霉素C，加入20 mg/L的長肽，培養(yǎng)1 h；用含10%已滅活胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸，計數(shù)2×108/L；取PBMCs，重懸計數(shù)2×109/L，荷肽的DC作為刺激細胞，兩者各取0.5 mL加入24孔板；隔日添加重組白細胞介素2(recombinant interleukin-2, rIL-2; 5×104U/L)，每3 d半量換液，并補加rIL-2； 1 周后收集細胞，以10∶1的比例與新鮮制備的荷肽DC共培養(yǎng)，進行第2輪刺激；第3次刺激后的第3天收集細胞，用于后續(xù)活性實驗[12]。

2.6IFN-γ分泌水平的檢測 取出酶聯(lián)免疫斑點實驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)板條(購自達科為生物技術(shù)有限公司)，加200 μL無血清的IMDM培養(yǎng)基進行封閉，靜置10 min；將前期誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細胞，調(diào)整細胞濃度為2×109/L，每孔加50 μL;荷肽的DC作為刺激細胞，補加40 μL的無血清IMDM培養(yǎng)基，設(shè)立對照孔和實驗孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無菌的去離子水，4 ℃裂解細胞10 min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標記的抗體，37 ℃孵育1 h；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buf-fer進行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯(lián)親和素，37 ℃孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer進行洗滌，方法同上；加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25 ℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀計數(shù) 96 孔板中每孔的斑點數(shù)[13]。

2.7羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester，CFSE)熒光染色檢測細胞毒性實驗 通過離心收集靶細胞，并將細胞重懸于含有1%FCS的PBS中，并將細胞濃度調(diào)節(jié)至1×109/L。致敏靶細胞：每1 mL細胞懸浮液加入0.5 μL 5 mmol/L CFSE(購自Sigma)，室溫、光照孵育4 min。對照靶細胞：每1 mL細胞懸液中加入0.5 μL 100 μmol/L CFSE，室溫、光照孵育4 min。將細胞用5% FCS-PBS洗滌1次，離心并除去上清液，將細胞重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細胞(前期誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細胞)在無血清IMDM培養(yǎng)基中洗滌1次，并以(1.25～5)×109/L的濃度重懸于無血清IMDM培養(yǎng)基中。將效應(yīng)細胞(分別為12.5∶1、25∶1和50∶1)與致敏的靶細胞在離心管中混合，靶細胞數(shù)為2×104，最終體積并在37℃溫育4 h孵育后，用含有1%FCS和0.1%疊氮化鈉的PBS(FACS)處理相同的E∶T致敏的靶細胞組和對照靶細胞組，并用FACS洗滌。離心，重懸在含4%多聚甲醛的PBS溶液中，流式細胞術(shù)檢測殺傷率。殺傷率(%)=(對照樣品中致敏靶細胞的數(shù)量-測試樣品中致敏靶細胞的數(shù)量)/對照樣品中致敏靶細胞的數(shù)量×100%。

2.8乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)實驗檢測細胞毒性 調(diào)整效應(yīng)細胞濃度 2×109/L；調(diào)整靶細胞A549細胞濃度為1×108/L，每孔加50 μL，即為每孔5 000個；按設(shè)置的效靶比加入效應(yīng)細胞及各種對照組，每孔終體積為100 μL； 37 ℃、 5% CO2孵育箱中孵育4 h，孵育結(jié)束前45 min，在靶細胞最大釋放組和體積校正組中各加入10 μL裂解液；離心孔板，1 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清50 μL至96孔板中；每孔加入50 μL乳酸脫氫酶底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔加入50 μL終止液；在酶標儀上設(shè)置490 nm波長測定吸光度(A)值。靶細胞殺傷率(%)=(實驗組A值-效應(yīng)細胞自發(fā)釋放組A值-靶細胞自發(fā)釋放組A值)/(靶細胞最大釋放組A值-靶細胞自發(fā)釋放組A值)×100%[14]。

2.9胞內(nèi)因子染色法檢測T細胞釋放IFN-γ水平 誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細胞，荷肽的DC作為刺激細胞；陰性對照孔每孔加入1×109/L的效應(yīng)細胞，終體積為1 mL；陽性對照孔每孔加入1×109/L的效應(yīng)細胞和100 μL 植物凝集素(phytohemagglutinin, PHA)再補加900 μL無血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入阻斷劑布雷菲德菌素A(brefeldin A, BFA; 5 mg/L)到培養(yǎng)體系中，充分混勻。于培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2孵育4 h；孵育結(jié)束后， 1 500 r/min 離心5 min，收集細胞，用含2% FBS溶液的PBS將細胞重懸。避光加入細胞表面抗體，4 ℃避光孵育20 min， 1 500 r/min 離心5 min。用細胞染色溶液洗滌2次，收集細胞，每孔加入100 μL破膜劑，4 ℃孵育20 min。收集細胞，加入抗IFN-γ抗體，4 ℃避光孵育30 min；每管加入500 μL細胞染色溶液，重懸，轉(zhuǎn)移到Falcon 圓底試管中上機檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0標準版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用GraphPad Prism軟件繪圖。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析檢驗多組均數(shù)之間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 COX-2 HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測以及長肽的設(shè)計結(jié)果

預(yù)測COX-2蛋白開放閱讀框中潛在的HLA-A2超型限制性CTL表位，依據(jù)NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB軟件的結(jié)果，選取在各個預(yù)測軟件中分值排名靠前的表位肽，當某一肽段SYFPEITHI的打分不太好，而IEDB和NetCTL 1.2打分較好時，我們也將其列入考慮范圍。設(shè)計長肽的長度我們盡量選擇包含已經(jīng)預(yù)測的較好的9個氨基酸肽段。所設(shè)計的長肽長度大概25個氨基酸左右。具體打分情況以及設(shè)計長肽結(jié)果見表1。

2 ELISPOT實驗檢測IFN-γ分泌水平結(jié)果

志愿者的PBMCs經(jīng)過GM-CSF和IL-4的誘導(dǎo)及LPS的刺激，成為成熟的DC。荷載長肽的DC刺激PBMCs 3輪后，ELISPOT實驗檢測誘導(dǎo)能分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量。與PBS組相比，3條長肽在志愿者中均誘導(dǎo)了很多可以分泌IFN-γ的T淋巴細胞(P<0.05)，見圖1。

3 LDH實驗檢測細胞毒性實驗結(jié)果

為了進一步驗證3條長肽特異性的CTL對靶細胞是否有殺傷，我們選擇A549細胞作為靶細胞(A549細胞是屬于COX-2+，HLA-0201+)，進行LDH實驗檢測細胞毒性，結(jié)果顯示，當效靶比是50∶1時，P315-338、P355-377和P375-401在志愿者中所誘導(dǎo)的CTL對靶細胞A549的殺傷率分別為31.3%、26.6%和36.6%，較PBS組顯著升高(P<0.05),見圖2。

表1 COX-2抗原HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測結(jié)果

Figure 1.ELISPOT assay was used to measure IFN-γ release by CTLs induced by DC from PBMCs of healthy donors. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

4 CFSE熒光染色檢測細胞毒性的實驗結(jié)果

候選肽所誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL，隨著效靶比的提高殺傷效果相應(yīng)提高。根據(jù)LDH實驗檢測細胞毒性實驗結(jié)果，我們將效果較好的P315-338和P375-401進一步用于CFSE熒光染色檢測細胞毒性實驗。這2條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時對靶細胞的殺傷率較陰性對照組(PBS組)和無關(guān)肽(HBcAg18-27)組HBC顯著升高(P<0.05),見圖3。

5 胞內(nèi)因子染色法檢測長肽體外免疫刺激后IFN-γ的分泌水平

從HLA-A2+健康供者得到的PBMCs，經(jīng)誘導(dǎo)刺激而成為成熟的DC，荷載長肽的DC刺激PBMCs 3輪后，并且體外培養(yǎng)18 d后獲得特異性的CTL，用胞內(nèi)因子染色法檢測長肽體外免疫刺激后IFN-γ分泌水平。P315-338和P375-401長肽疫苗誘導(dǎo)的CTL可以分泌較多的IFN-γ (P<0.05)，見圖4。

Figure 2.Specific lysis of A549 cells by the synthetic long peptide-induced CTLs. The effector/target (E/T) ratios were 12.5∶1, 25∶1 and 50∶1. The levels of LDH release were detected. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27 were used as negative control. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

討 論

肺癌是嚴重威脅人類健康和生命的疾病。因吸煙和環(huán)境因素的影響，肺癌的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢。肺癌發(fā)病率逐年上升，全世界每年新確診肺癌患者約160萬，其病死率在惡性腫瘤引起的死亡中居首位。肺癌是發(fā)達國家男性癌癥死亡的最常見原因，也是女性的主要原因之一[15]。腫瘤免疫治療是通過增強患者機體抵抗力和對腫瘤的免疫反應(yīng)以達到遏制腫瘤的治療方法[16],其中以anti-PD1抗體和嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptorT-cell，CAR-T)療法較常見。目前，美國FDA已批準PD-1可用于惡性黑色素瘤和肺鱗癌的臨床治療。免疫治療在惡性腫瘤治療領(lǐng)域有廣闊前景。目前，免疫治療已廣泛應(yīng)用于肺癌治療[17]。

Figure 3.Specific lysis of target cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donor. Detection of antigen-specific cytotoxicity by CFSE assay was perdormed. The effector/target (E/T) ratios were 12.5∶1, 25∶1 and 50∶1. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27 were used as negative control. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

Figure 4.In long peptide-pulsed DC assay, IFN-γ release was measured by intracellular cytokine staining assay.The long peptide-pulsed DC was used to induce CTLs from the peripheral blood mononuclear cells of HLA-A*02 healthy volunteers. The CTLs were then stained with IFN-γ and CD8 antibodies. The number in the figure represented the percentage of IFN-γ positive cells among CD8+ T cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

隨著多肽疫苗的應(yīng)用[18-19]，多肽疫苗在原有誘導(dǎo)CTL能力的基礎(chǔ)上也有新的進展。這些進展多表現(xiàn)在增強多肽疫苗抗腫瘤效應(yīng)的策略方面,如提高CTL表位的免疫原性，與T輔助表位的聯(lián)用，增加多肽的長度，克服HLA分子限制性等[20-21]。杜宇琛等[22]研究發(fā)現(xiàn)，使用含CpG序列的寡脫氧核糖核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG-ODN)刺激成熟的 DC 與 Lewis 肺癌細胞系(LLC-1)融合的 DC 疫苗，在體內(nèi)能產(chǎn)生高效、持久的抗肺癌免疫反應(yīng)，而肺癌細胞系與成熟的 DC共培養(yǎng)卻不能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。有學(xué)者用樹突狀細胞與IL-18基因修飾的 NCI-H460肺癌細胞融合體進行抗腫瘤研究，發(fā)現(xiàn)融合細胞能有效激活宿主抗腫瘤的免疫反應(yīng)；小鼠體內(nèi)實驗表明，融合細胞能有效減慢荷瘤小鼠的腫瘤生長速度。由此表明，DC 融合疫苗接種有望成為疫苗免疫治療的新策略。

本實驗結(jié)果可見P315-338和P375-401有很好的分泌IFN-γ的能力及殺傷靶細胞的能力。DC荷肽組實驗，將誘導(dǎo)成熟的DC荷載上長肽可刺激PBMCs。長肽在經(jīng)過專職抗原提呈細胞加工處理后，其誘導(dǎo)的T細胞分泌IFN-γ的能力會提高[23]。長肽由于它的長度不能直接結(jié)合在抗原結(jié)合槽上，必須被抗原提呈細胞吞噬、加工。專職抗原提呈細胞對抗原加工處理的效果比較明顯[24]。目前也有一些負載多肽的DC作為疫苗進行研究的，而DC激動劑等方面的試劑作為腫瘤的輔助治療也有應(yīng)用[25]。依據(jù)軟件預(yù)測設(shè)計的長肽，雖然不是每一條都可以引起較好的免疫反應(yīng)，但我們?nèi)匀缓Y選出了效果較好的肽，所以長肽可以作為一種很好的多肽疫苗[26]，我們雖然證明長肽最終誘導(dǎo)了很好的特異性的T細胞，但并沒有指出長肽被加工成了哪些肽段，有沒有加工成與MHCⅡ分子結(jié)合的CD4+Th表位。這些問題應(yīng)該是下一步需要我們?nèi)パ芯拷鉀Q的。