申屠路媚， 盧 敏， 王 燕， 牟艷玲△

(1濟(jì)南大學(xué)-山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250200； 2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所， 國(guó)家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南 250062)

隨著人們生活水平的提高以及肥胖發(fā)生率的增加，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，心血管并發(fā)癥是DM患者死亡的主要原因，其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是DM心血管并發(fā)癥中一種獨(dú)立、特異的心肌病，與糖尿病患者發(fā)生心力衰竭和死亡率升高密切相關(guān)[1]。

含F(xiàn)框/WD重復(fù)域蛋白7(F-box/WD repeat-containing protein 7，F(xiàn)BXW7)是F-box蛋白家族成員，為 Skp-Cullin-F-box(SCF)E3泛素連接酶體系的靶蛋白識(shí)別組分[2]。FBXW7作為一種腫瘤抑制基因，可通過介導(dǎo)泛素蛋白酶體途徑降解多種癌蛋白，如cyclin E、c-Myc、mTOR、Notch1和低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)等，在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤抗藥性等多個(gè)方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-5]。研究表明，mTOR[6]、Notch[7]及RhoA[8]等均可參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。此外還有研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管生成，在一定程度上起到減輕冠心病的作用，但FBXW7對(duì)DCM發(fā)生發(fā)展的作用尚未見報(bào)道。本文通過Western blot和免疫組化方法檢測(cè)FBXW7在DCM中的表達(dá)情況，初步探討FBXW7在DCM發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化，為糖尿病心肌病的防治尋找新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性 SD大鼠72只，SPF級(jí)，體重 180～200 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)為SCXK(魯)2014-0007。

2 材料與試劑

鏈脲佐菌素和戊巴比妥鈉(Sigma)；血糖試紙(強(qiáng)生中國(guó)醫(yī)療器材有限公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(SA1020，武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；濃縮型 DAB試劑盒和II抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot 細(xì)胞裂解液、Western blot實(shí)驗(yàn)用的I 抗、II抗稀釋液、Western blot轉(zhuǎn)膜液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Pro-Sieve Color protein markers (Lonza)；PVDF膜(0.45 μm，SERVA)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore)；抗FBXW7抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(Cell Signaling Technology)。

3 儀器

DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；Wallac 1420 型多標(biāo)記酶標(biāo)儀(Perkin Elmer)；RM2235型石蠟包埋機(jī)和EG1150型切片機(jī)(Leica)；J-25 型高速冷凍離心機(jī)(Beckman)；LAS4000 型化學(xué)發(fā)光成像儀(Fujifilm)；Eclipse TE2000-S 型免疫熒光顯微鏡(Nikon)。

4 方法

4.1糖尿病大鼠模型的建立 健康雄性 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重均衡的原則隨機(jī)分為非糖尿病組(non-diabetic，ND組)30只和糖尿病模型組(DM組)42只。造模前禁食16 h，DM組大鼠一次性腹腔注射1% 鏈脲佐菌素(60 mg/kg， 用pH4.4檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液于4 ℃配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，ND組正常大鼠注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。72 h 后尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖 (fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG≥16.7 mmol/L為DM模型成功，本次造模成功38只。再將ND組正常大鼠隨機(jī)分為4、8 和 12 周空白對(duì)照組，每組10只；DM組造模成功大鼠隨機(jī)分為4、8和12周模型組(4W-DM、 8W-DM和12W-DM組)，每組分別為12只、13只和13只。

4.2標(biāo)本收集 大鼠麻醉，開胸，迅速取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水洗凈，剔除血管和脂肪等非心肌組織，濾紙吸干水分后稱心臟重量和左心室(含室間隔)重量，并計(jì)算心臟(左心室)指數(shù)=心臟(左心室)重量(mg)/體重(g)。分離的左心室再分為2部分：一部分用福爾馬林固定，經(jīng)脫水、透明、包埋，制成心肌組織石蠟塊；另一部分置于EP管，于液氮中保存待用。

4.3HE染色 取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色10 min，流水稍洗，體積分?jǐn)?shù)為0.01的鹽酸乙醇分化，流水沖洗數(shù)分鐘，伊紅染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)的改變。

4.4Western blot實(shí)驗(yàn) 每20 mg心肌組織中加入100～200 μL含1 mmol/L PMSF的裂解液，制備組織勻漿，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取勻漿上清，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。每孔40～60 μg 總蛋白上樣量以濃度為8%的凝膠電泳進(jìn)行分離，冰浴下恒流(300 mA)濕法轉(zhuǎn)膜2 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h后，與相應(yīng) I 抗4 ℃共孵育過夜，抗體稀釋比例分別為1∶800(FBXW7)和1∶1 000(β-actin)；次日TBS-T洗液(pH 7.6)洗滌后，與辣根酶標(biāo)記的II 抗共孵育3 h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并利用ImageJ2x灰度分析軟件定量分析，以 β-actin 的灰度值標(biāo)化蛋白表達(dá)。

4.5免疫組化染色 取石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌，浸入體積分?jǐn)?shù)為0.03 的過氧化氫封閉液中，室溫封閉30 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。枸櫞酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)高壓3 min以修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫。PBS 洗滌后滴加 I 抗，4 ℃濕盒過夜，抗體稀釋比例為FBXW7 (1∶800)。次日切片恢復(fù)至室溫后，分別滴加 II 抗和辣根酶標(biāo)記工作液，37 ℃溫箱分別孵育 20 min。PBS洗滌后DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，自來(lái)水水洗返藍(lán)，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察結(jié)果。每組隨機(jī)取 10個(gè)視野，通過Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均積分吸光度。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，各項(xiàng)指標(biāo)組間差異比較采用單因素方差分析及Boferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠模型建立情況

實(shí)驗(yàn)期間，ND組大鼠一般狀態(tài)良好、健壯、皮毛有光澤，自主活動(dòng)正常，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，無(wú)死亡。與ND組比較，DM組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲[(63.6±5.2)vs(282.2±65.5) mL/24 h]、多食[(24.7±1.9)vs(52.1±9.4) g/24 h]、多尿[(3.7±1.3)vs(224.3±42.8) mL/24 h]和消瘦，精神萎靡，皮毛無(wú)光澤，腥臊酮臭味加重，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多飲、多食、多尿和消瘦表現(xiàn)加重，大鼠生存狀態(tài)越來(lái)越差，造模成功38只，成功率為90%。

2 大鼠體重及心臟各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

在4、 8和12周時(shí)，ND組大鼠體重明顯增加，F(xiàn)BG正常；與ND組相比，DM組大鼠體重明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)BG明顯升高(P<0.01)。此外，DM組大鼠心臟及左心室重量均比ND組明顯降低(P<0.01)，但心臟指數(shù)和左心室指數(shù)均顯著高于ND組(P<0.01)，見表1。

表1 糖尿病大鼠的一般特征

BW: body weight; HW: heart weight; LVW: left ventricular weight; HWI: HW/BW; LVWI: LVW/BW; FBG: fasting blood glucose. These indexes were evaluated and calculated at the end of the protocol time.**P<0.01vsND group.

3 大鼠心肌組織病理觀察結(jié)果

ND組大鼠心肌紋理清晰，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核均勻分布，無(wú)變性、壞死等病理結(jié)構(gòu)改變。DM 組大鼠均觀察到不同程度的病變，4周DM組心肌細(xì)胞胞漿豐富，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，排列紊亂，可見個(gè)別心肌細(xì)胞壞死；8周DM組局部大量心肌細(xì)胞壞死，壞死心肌細(xì)胞胞漿紅染；12周DM組可見心肌細(xì)胞肥大且局部不同程度凝固性變性、壞死，胞漿嗜酸性增強(qiáng)，核固縮深染，見圖1。

Figure 1.The pathological structural changes of the cardiac myocardium (HE staining, ×200).

4 FBXW7在大鼠心肌中的表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DM組大鼠相對(duì)于ND組心肌組織中FBXW7 的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，且8周DM組表達(dá)量明顯高于4周DM組(P<0.01)，維持在較高水平；12周DM組表達(dá)顯著低于8周DM組(P<0.01)，但仍高于ND組(P<0.01),見圖2。

Figure 2. The myocardial expression levels of FBXW7 in diffe-rent groups tested by Western blot. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs ND group; ##P<0.01 vs 4W-DM group; △△P<0.01 vs 8W-DM group.

免疫組化觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7在心肌細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞核，少量在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。FBXW7在各組中的表達(dá)量趨勢(shì)與Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：4周和8周DM組表達(dá)量顯著高于ND組(P<0.01)，且8周DM組表達(dá)量高于4周DM組(P<0.05)；12周DM組表達(dá)量相對(duì)于8周DM組顯著減少(P<0.01)，但仍明顯高于ND組(P<0.05)，見圖3。

討 論

DCM的始動(dòng)因素是心肌能量代謝異常，包括糖和乳酸鹽代謝減少，脂肪代謝增加，從而導(dǎo)致游離脂肪酸的堆積，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)氧化應(yīng)激、線粒體損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)增加和心肌纖維化等病理改變，同時(shí)出現(xiàn)心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變[12-13]。本研究中，DM組大鼠FBG明顯升高，體重明顯低于ND組；4、8和12周DM組大鼠心臟及左心室重量均明顯降低，但心臟指數(shù)和左心室指數(shù)均明顯高于ND組，表明DM組大鼠可能出現(xiàn)心肌肥大。隨著研究時(shí)期的延長(zhǎng)，DM組大鼠心肌出現(xiàn)局部變性甚至壞死，表明DM組大鼠心肌出現(xiàn)了不同程度時(shí)間依賴性的心肌損傷以及DCM模型的成功。

Figure 3.The myocardial expression of FBXW7 in different groups tested by immunohistochemistry (×400). Positive expression was visualized by brown staining. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs ND group; #P<0.05 vs 4W-DM group; △△ P<0.01 vs 8W-DM group.

FBXW7作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的抑癌基因，在人體細(xì)胞周期的進(jìn)程、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化起重要的調(diào)節(jié)作用，其缺失能引起和加快癌細(xì)胞增殖。Matsuoka等[14]發(fā)現(xiàn) FBXW7是造血系統(tǒng)重要的防御因子，其缺失會(huì)導(dǎo)致造血系統(tǒng)細(xì)胞不成熟和急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生；Yokobori等[15]發(fā)現(xiàn)p53控制FBXW7的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致FBXW7在胃癌組織中的表達(dá)降低，不良預(yù)后增加；Iwatsuki等[16]發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中 FBXW7的表達(dá)明顯低于相應(yīng)正常組織，F(xiàn)BXW7表達(dá)低提示預(yù)后不良。越來(lái)越多的研究顯示，F(xiàn)BXW7可通過參與各種信號(hào)通路對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起調(diào)控作用。Li 等[17]運(yùn)用Pearson相關(guān)系數(shù)分析表明FBXW7在胃癌組織中的表達(dá)與RhoA蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且FBXW7 通過調(diào)控泛素蛋白酶體的降解來(lái)調(diào)節(jié)RhoA水平，說(shuō)明胃癌中 FBXW7 通過 RhoA信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)停滯和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。有研究[18]發(fā)現(xiàn)Polo樣激酶2(Plk2)通過靶向結(jié)直腸癌中的FBXW7/細(xì)胞周期蛋白E途徑來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和凋亡，通過恢復(fù)FBXW7表達(dá)和細(xì)胞周期蛋白E的消耗，Plk2的促腫瘤活性可以被反轉(zhuǎn)。涂康生等[19]證實(shí)FBXW7是一個(gè)肝細(xì)胞癌的抑癌基因，且其通過泛素化蛋白酶解下調(diào)YAP蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)停滯，因此FBXW7可以通過Hippo-YAP信號(hào)通路發(fā)揮抑癌功能。

另有相關(guān)研究表明FBXW7與冠心病的發(fā)生具有相關(guān)性。Onoyama等[20]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7調(diào)節(jié)小鼠肝臟脂質(zhì)代謝和脂肪細(xì)胞分化；還有研究[21]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7通過針對(duì)性降解C/EBPα，從而控制脂肪細(xì)胞分化。因此，F(xiàn)BXW7可能是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)能量和脂質(zhì)代謝的蛋白，提示FBXW7可能與冠心病有關(guān)。FBXW7還能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管生成，可以在一定程度上起到減輕冠心病的作用[9-11]。我們通過Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了FBXW7在DCM中的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示FBXW7在大鼠心肌中主要表達(dá)于細(xì)胞核，少量在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；各糖尿病模型組大鼠相對(duì)于正常對(duì)照組心肌組織中FBXW7 的表達(dá)量顯著增加，且8周 DM組表達(dá)量明顯高于4周 DM組，維持在較高水平，12周DM組表達(dá)增加量減少，明顯低于8周DM組。FBXW7在4周、8周和12周DM組大鼠心肌組織中的表達(dá)變化趨勢(shì)，我們猜測(cè)可能是由機(jī)體代償反應(yīng)引起的，但是，F(xiàn)BXW7在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用還需進(jìn)一步研究。

糖尿病心肌病是糖尿病性心臟病的特異性病變，是糖尿病心血管嚴(yán)重并發(fā)癥的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)揭示了FBXW7在糖尿病心肌病中有表達(dá)且隨病程延長(zhǎng)其表達(dá)呈一定變化趨勢(shì)， 下一步我們將深入研究其在糖尿病心肌病中的作用并闡明其機(jī)制，以期為糖尿病心肌病的治療提供新的理論依據(jù)。