金 艷，王英哲，陳晶晶，郭 強(qiáng)，徐 博

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130118)

全世界有近三分之一的土地是鹽堿地，如何減輕鹽堿地對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的脅迫，使廢棄地得到改良和合理利用，是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所面臨和急需解決的課題[1]。紫花苜蓿(Medicagosativa)具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性、穩(wěn)定的生產(chǎn)力[2]以及較高的營養(yǎng)價(jià)值[3]，在我國農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮著巨大作用[4]。我國苜蓿產(chǎn)業(yè)尚在初級(jí)階段[5]，未來更重要的是提高苜蓿的抗鹽性，從而提高其品質(zhì)[6]。因此，選育耐鹽紫花苜蓿品種既能提高鹽堿地的利用率，擴(kuò)大紫花苜蓿種植面積，增加其產(chǎn)量，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展，又可以改良土壤，保持水土和保護(hù)生態(tài)環(huán)境[7]。

大量研究表明不同紫花苜蓿品種的耐鹽性差異很大，評價(jià)不同品種的抗逆性一直是育種學(xué)家挖掘和培育抗性品種的常用手段[8]。Al-khatib等[9]和李源等[10]研究表明，紫花苜蓿在發(fā)芽期、苗期對鹽比較敏感，生長后期相對不敏感，認(rèn)為苗期是耐鹽鑒定的最佳時(shí)期。因此，本研究選取紫花苜蓿雜交組合的苗期作為測定時(shí)期。鹽脅迫能直接影響細(xì)胞的膜脂和膜蛋白，使膜脂過氧化，膜系統(tǒng)受損，膜脂透性增大，從而影響膜的正常生理功能。植物在逆境條件下，滲透壓相關(guān)的調(diào)節(jié)物質(zhì)變化明顯[11]。丙二醛(MDA)等作為脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物其含量可代表膜損傷程度的大小，可溶性蛋白和可溶性糖是很多非鹽生植物的主要滲透調(diào)節(jié)劑，在植物對鹽脅迫的適應(yīng)調(diào)節(jié)中是增加滲透性溶質(zhì)的重要組成成分[12]。利用不同品種紫花苜蓿不育系MS-GN及在吉林省地區(qū)適應(yīng)性強(qiáng)的父本材料配置雜交組合，對不同濃度NaCl溶液處理下的14個(gè)紫花苜蓿雜交組合F1代苗期的生理指標(biāo)變化進(jìn)行研究，以期篩選出對鹽脅迫耐受性更強(qiáng)的紫花苜蓿雜交組合，為耐鹽性紫花苜蓿雜交種選育提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為14個(gè)不同品種紫花苜蓿的優(yōu)良單株為父本，優(yōu)良不育系MS-GN為母本構(gòu)建的雜交組合F1代(表1)，雜交組合F1代為父本母本一對一，具有較高的穩(wěn)定性，供試材料來自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

表1 14個(gè)紫花苜蓿品種名稱及種子來源Table 1 Names and seed source of 14 alfalfa varieties

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)處理 試驗(yàn)于2017年3月20日至5月末在吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院草業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。挑選籽粒飽滿的紫花苜蓿雜交組合種子，培養(yǎng)于滅菌的營養(yǎng)土花盆中，花盆高15 cm、口徑10 cm，每盆10粒種子，每個(gè)品種16盆，做好標(biāo)記后移至HPG-400HX人工氣候箱培養(yǎng)60 d。配制不同濃度(50、100、150、200 mmol·L-1)NaCl溶液，每個(gè)品種分5組，每組3盆即為3個(gè)重復(fù)，每盆澆灌5 mL相應(yīng)濃度的NaCl溶液，每3 d處理一次，共處理3次，余下的一盆作為對照，每次處理時(shí)對照加等量的蒸餾水，9 d后，測定過氧化氫酶(CAT)活性炭、丙二醛(MDA)、可溶性糖、可溶性蛋白含量。每個(gè)處理需測量指標(biāo)的樣葉一次性采集，不能一次性測完的剩余樣品放入密封袋，置于4 ℃低溫冰箱保存，3 d內(nèi)完成所有指標(biāo)測定。

1.2.2測定方法與指標(biāo) 本研究所使用的試劑盒統(tǒng)一購買于南京建成生物工程研究所。稱取0.15 g新鮮葉片剪碎，加入0.05 mol·L-1、pH 7.8的磷酸緩沖液1.5 mL及少量的石英砂于研缽中研磨，研磨成勻漿后移至2 mL離心管中，5 000 r·min-1、4 ℃下離心10 min，取上清液，用于指標(biāo)測定。CAT活性的測定采用可見光法[13]；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，測定532 nm下的吸光度[13]；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法，在620 nm下測定吸光度值[14]；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法。

1.3 綜合評價(jià)方法

采用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評判[15-16]。

與耐受性正相關(guān)的參數(shù)可溶性蛋白、可溶性糖、CAT采用以下公式：

U(XIJK)=(XIJK-XMIN)/(XMAX-XMIN)。

(1)

與耐受性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)MDA采用以下公式:

U(XIJK)=1-(XIJK-XMIN)/(XMAX-XMIN)。

(2)

式中：U(XIJK)為第I個(gè)雜交材料第 J個(gè)濃度處理的第K項(xiàng)指標(biāo)的隸屬度，且U(XIJK)∈[0,1]；XIJK表示第I個(gè)雜交材料，第J個(gè)濃度處理的第K個(gè)指標(biāo)測定值；XMAX、XMIN為所有參試種中第K項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均采用Excel 2007、SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAT活性的變化

對照組中，1號(hào)活性相對較小，5號(hào)活性明顯高于其他雜交材料(表2)；50 mmol·L-1NaCl濃度處理后，4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)，14號(hào)含量與對照組相比下降，其余材料含量均升高；100 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、9號(hào)含量下降，其余含量增加；150 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比3號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)降低，其余材料含量均增加；200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、14號(hào)含量降低，其余含量均升高，1號(hào)尤為明顯。

同一NaCl濃度不同雜交組合相互比較，在對照組中，5號(hào)CAT活性最高，1號(hào)CAT活性最低；50 mmol·L-1NaCl濃度處理，3號(hào)CAT活性最高，14號(hào)CAT活性最低；100 mmol·L-1NaCl濃度處理下，8號(hào)CAT活性號(hào)最高，3號(hào)CAT活性最低；150 mmol·L-1NaCl濃度處理下，13號(hào)CAT活性最高，10號(hào)CAT活性最低；200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，1號(hào)CAT活性號(hào)最高，11號(hào)CAT活性最低。

2.2 MDA含量的變化

對照組中，不同材料之間1號(hào)MDA含量最高(表3)，7號(hào)、11號(hào)含量均低于1 mmol·mg-1；在200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比1號(hào)含量有所降低但幅度不明顯(P>0.05)；8號(hào)在100、150、200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比含量顯著降低(P<0.05)；其余材料在不同濃度條件下與對照組相比均呈現(xiàn)增加趨勢。

同一NaCl濃度不同雜交組合相互比較，在對照組中，1號(hào)MDA含量最高，11號(hào)MDA含量最低；50 mmol·L-1NaCl濃度處理后，3號(hào)MDA含量最高，12號(hào)MDA含量最低；100 mmol·L-1NaCl濃度處理下，13號(hào)MDA含量號(hào)最高，8號(hào)MDA含量最低；150 mmol·L-1NaCl濃度處理下，4號(hào)MDA含量號(hào)最高，9號(hào)MDA含量最低；200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，4號(hào)MDA含量號(hào)最高，8號(hào)MDA含量最低。

表2 不同處理下對CAT活性的影響Table 2 Effect of different treatments on CAT activity U·g-1

雜交組合序號(hào)1-14同表1；同行不同小寫字母表示同一雜交組合不同NaCl濃度間差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示相同NaCl濃度不同雜交組合差異顯著(P<0.05)。下同。

Cross combination numbers 1-14 are same to Table 1； Different lowercase letters within the same row indicate significant difference among different NaCl concentrations. Different capital letters within the same column indicate significant difference among different hybrid combinations at the 0.05 level; similarly for the following tables.

表3 不同處理下對MDA含量的影響Table 3 Effect of different treatments on MDA content mmol·g-1

2.3 可溶性糖含量的變化

對照組中，雜交組合5號(hào)、7號(hào)含量較低，12號(hào)含量最高(表4)；50 mmol·L-1NaCl濃度處理下，4號(hào)、9號(hào)、12號(hào)、13號(hào)、14號(hào)含量與對照組相比降低，7號(hào)變化不明顯，其余含量均增加；100 mmol·L-1NaCl濃度處理下，1號(hào)、3號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、12號(hào)、13號(hào)含量與對照組相比降低，7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)含量增加但增幅不明顯(P>0.05)，其余含量均顯著升高(P<0.05)；150 mmol·L-1NaCl濃度處理下，8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、13號(hào)含量與對照組相比降低，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、14號(hào)含量增加但增幅不明顯，其余含量均顯著增加，6號(hào)尤其明顯；200 mmol·L-1NaCl濃度處理下,8號(hào)、13號(hào)、14號(hào)含量與對照組相比顯著降低，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、12號(hào)含量升高但幅度不明顯，其余含量均顯著增加。

同一NaCl濃度不同雜交組合相互比較，在對照組中，12號(hào)可溶性糖含量最高，7號(hào)可溶性糖含量最低；50 mmol·L-1NaCl濃度處理后，6號(hào)可溶性糖含量最高，9號(hào)可溶性糖含量最低；100 mmol·L-1NaCl濃度處理下，4號(hào)可溶性糖含量最高，9號(hào)可溶性糖含量最低；150 mmol·L-1NaCl濃度處理下，6號(hào)可溶性糖含量最高，9號(hào)可溶性糖含量最低；200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，4號(hào)可溶性糖含量最高，8號(hào)可溶性糖含量最低。

表4 不同處理下對可溶性糖含量的影響Table 4 Effect of different treatments on soluble sugar content mg·g-1

2.4 可溶性蛋白含量的變化

對照組中，雜交組合12號(hào)含量最高，9號(hào)含量最低，兩者差異顯著(表5)；50 mmol·L-1NaCl濃度處理后，與對照組相比3號(hào)、4號(hào)、8號(hào)、12號(hào)、13號(hào)含量顯著下降(P<0.05)，其余含量均顯著增加；100 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比1號(hào)、12號(hào)、13號(hào)含量顯著降低，其余含量均增加且增幅明顯；150 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、10、11號(hào)、12號(hào)含量降低，其余含量均增加；200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，與對照組相比1號(hào)、2號(hào)、7號(hào)、12號(hào)、13號(hào)含量降低，其余含量均升高。

同一NaCl濃度不同雜交組合相互比較，在對照組中，12號(hào)可溶性蛋白含量最高，11號(hào)可溶性蛋白含量最低；50 mmol·L-1NaCl濃度處理后，2號(hào)可溶性蛋白含量最高，3號(hào)可溶性蛋白含量最低；100 mmol·L-1NaCl濃度處理下，3號(hào)可溶性蛋白含量最高，12號(hào)可溶性蛋白含量最低；150 mmol·L-1NaCl濃度處理下，1號(hào)可溶性蛋白含量最高，10號(hào)可溶性蛋白含量最低；200 mmol·L-1NaCl濃度處理下，9號(hào)可溶性蛋白含量最高，12號(hào)可溶性蛋白含量最低。

2.5 綜合評價(jià)

紫花苜蓿對氯化鈉的耐受性與多個(gè)指標(biāo)相關(guān)，通過隸屬函數(shù)法求得每個(gè)雜交組合在不同濃度NaCl溶液處理下的CAT活性、MDA含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量的隸屬函數(shù)值，并求其平均值，做綜合評價(jià)(表6)。其中3號(hào)、2號(hào)、12號(hào)、4號(hào)、9號(hào)這5個(gè)雜交組合的加權(quán)平均值均大于0.5，耐鹽性較強(qiáng)。各雜交組合的耐受性排序?yàn)榻M合3×M>組合2×M>組合12×M>組合4×M>組合9×M>組合5×M>組合7×M>組合6×M>組合14×M>組合13×M>組合8×M>組合11×M>組合10×M>組合1×M。

表5 不同處理下對可溶性蛋白含量的影響Table 5 Effect of different treatments on soluble protein content mg·g-1

表6 隸屬函數(shù)值Table 6 Subordinate function values

3 討論

3.1 利用不育系雜交評選的優(yōu)勢

國內(nèi)外大量的作物育種實(shí)踐證實(shí)，利用植物雄性不育系雜交制種可以降低生產(chǎn)成本，充分發(fā)揮品種的增產(chǎn)潛力，是獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)作物新品種和高純度種子的有效途徑[17-18]。前人的研究[19]結(jié)果表明，通過利用紫花苜蓿雄性不育系配置雜交組合，對F1代的雜種優(yōu)勢進(jìn)行了評價(jià)分析。相關(guān)結(jié)果也顯示，即使從對雜交組合后代的農(nóng)藝學(xué)和品質(zhì)性狀評價(jià)的結(jié)果來看，不同親本得到的雜交組合后代的性狀存在性狀分離的現(xiàn)象[20]。而本研究在雜交組合F1代通過受到鹽脅迫后各生理響應(yīng)的評價(jià)結(jié)果，以及其綜合評價(jià)賦值的結(jié)果來看，在其耐鹽性方面，同一母本不同父本材料的雜交F1代耐鹽性差異顯著，與前人的研究結(jié)果相符。但這僅是在雜交后代中進(jìn)行評價(jià)，為培育耐鹽性強(qiáng)且農(nóng)藝學(xué)性狀優(yōu)異的紫花苜蓿雜交種，應(yīng)進(jìn)一步在其父本選擇上引入耐鹽性綜合評價(jià)，并適當(dāng)進(jìn)行自交性狀純合后再配置雜交組合。

3.2 雜交組合F1代的MDA等指標(biāo)對鹽脅迫的生理響應(yīng)

植物苗期對鹽脅迫更為敏感，因此苗期的耐鹽性能夠代表植物的耐鹽程度[21]。耐鹽性受遺傳基礎(chǔ)和環(huán)境因素的制約，常因其生理過程的復(fù)雜性、環(huán)境因子的多變性和兩者互作的綜合性而異，因此，不同種甚至是同一種不同生態(tài)型植物之間耐鹽性也存在很大的差異[22]。MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低和細(xì)胞質(zhì)膜透性的變化是反映細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo)[23]。本研究中，除1號(hào)、8號(hào)雜交組合的MDA含量呈降低趨勢外，其余雜交組合MDA含量均升高(表3)，說明雜交組合幼苗體內(nèi)MDA的積累，降低了質(zhì)膜過氧化水平，從而表現(xiàn)出一定的抗逆性。CAT能將H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧氣，是能防止細(xì)胞受傷害的最有效的抗氧化酶[24]。本研究中，經(jīng)過不同濃度NaCl溶液處理后，1號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、10號(hào)、12號(hào)、13號(hào)CAT活性整體呈上升趨勢(表2)。說明這些雜交組合在經(jīng)過NaCl處理后通過積累CAT，加速清除體內(nèi)的活性氧，以提高自身的抗逆性?？扇苄蕴堑暮颗c滲透脅迫具有很強(qiáng)的相關(guān)[25]，可溶性糖能維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[26]。1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、11號(hào)在NaCl處理后可溶性糖含量較對照組有所升高(表4)，表明當(dāng)雜交組合幼苗受到不良環(huán)境的脅迫時(shí)會(huì)增加體內(nèi)的可溶性糖含量。3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、14號(hào)雜交組合受不同濃度NaCl處理后，可溶性蛋白含量較對照組增幅明顯(表5)，說明可溶性蛋白高含量有利于植物細(xì)胞維持較低的滲透勢，增強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力，從而緩解因鹽離子大量進(jìn)入細(xì)胞和植株失水帶來的傷害及次生傷害[11]。以上4種測定的生理指標(biāo)都可作為反映紫花苜蓿雜交組合對鹽耐受性的重要指標(biāo)。本研究中，根據(jù)對測定指標(biāo)的分析，可看出各雜交組合對鹽脅迫的響應(yīng)存在一定差異。本研究對供試紫花苜蓿雜交組合耐鹽性采用NaCl進(jìn)行單鹽處理,缺點(diǎn)是離子組成與大田試驗(yàn)情況相差較大，鑒定結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

單一指標(biāo)隸屬函數(shù)值的大小并不能代表雜交組合最終的耐鹽性，因此運(yùn)用綜合評價(jià)方法能有效反映出雜交組合的耐鹽性[27]。本研究采用隸屬函數(shù)法對14個(gè)紫花苜蓿雜交組合的耐鹽性進(jìn)行綜合評價(jià)，并選擇各指標(biāo)的相對值進(jìn)行分析，消除了材料間固有差異，可以較準(zhǔn)確比較其耐鹽性。通過計(jì)算各項(xiàng)參數(shù)的隸屬函數(shù)值，綜合評價(jià)14個(gè)雜交組合，并對其進(jìn)行排序，結(jié)果為組合3×M>組合2×M>組合12×M>組合4×M>組合9×M>組合5×M>組合7×M>組合6×M>組合14×M>組合13×M>組合8×M>組合11×M>組合10×M>組合1×M。對應(yīng)材料來源可知，騎士-2(2010)、WL319HQ、維多利亞(Victorian)、阿迪娜(Adrenalin)等品種與MS-GN雜交后F1代對鹽具有較高的耐受性。