(安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，蕪湖 241000)

貓爪草為毛莨科植物小毛莨的塊根，具有調(diào)免疫、抗腫瘤、抗氧化等作用[1-2]，免疫活性部位的篩選試驗(yàn)表明多糖是其重要活性成分之一。采用水提醇沉法所得的貓爪草粗多糖中含有大量色素，需進(jìn)一步精制純化?；诖耍疚奶接懥穗p氧水脫除貓爪草多糖色素的工藝條件，并利用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以期為貓爪草多糖的脫色處理提供參考。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

貓爪草購(gòu)于安徽亳州中藥材市場(chǎng)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校汪榮斌教授鑒定為毛莨科植物小毛莨的塊根；FA1204N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(西安禾普生物科技有限公司)；80-2B離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海翱藝儀器有限公司)；苯酚、無(wú)水乙醇、雙氧水(質(zhì)量濃度30%)等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1貓爪草多糖的制備 將貓爪草粉碎后用石油醚回流脫脂3次，每次6h。而后加20倍量水，于90℃提取2次，每次2h。合并上清液并減壓濃縮，加4倍體積無(wú)水乙醇，冷藏過(guò)夜。收集沉淀得貓爪草粗多糖。用蒸餾水溶解至1.0mg/ml，作待脫色液備用。

1.2.2多糖含量測(cè)定-苯酚硫酸法 具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。

1.2.3多糖保留率與色素脫除率的計(jì)算

(1)

(2)

式1中，M1示脫色之前多糖質(zhì)量，M2示脫色之后多糖質(zhì)量。式2中，A1示脫色處理之前溶液450 nm處的吸光度，A2示脫色處理之后溶液450 nm處的吸光度。

1.2.4單因素試驗(yàn) 取50ml待脫色液5份，以脫色率及多糖保留率為指標(biāo)，考察脫色時(shí)間(20、40、60、80、100min)、脫色pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、脫色溫度(35℃、45℃、55℃、65℃、75℃)、雙氧水用量(5%、10%、15%、20%、25%)4個(gè)因素對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響。

1.2.5正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定pH 9.0，以多糖脫色率為考察指標(biāo)，選擇脫色時(shí)間(A)、脫色溫度(B)、雙氧水用量(C)進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化貓爪草多糖脫色工藝，各因素水平安排如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色時(shí)間對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

在20～60min的脫色時(shí)間范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，貓爪草多糖脫色率迅速?gòu)?5.4%提高至78.9%。但60 min以后，脫色率變化較小。而多糖保留率隨脫色時(shí)間的延長(zhǎng)不斷降低，且60min后降低速度加快?？赡茉蚴请p氧水氧化色素同時(shí)也在氧化多糖，脫色時(shí)間越長(zhǎng)多糖損失越多。因此，應(yīng)選擇脫色時(shí)間為60min較為適宜。見(jiàn)圖1。

2.2 脫色pH對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

貓爪草多糖的脫色率隨pH值的升高而逐漸提高。pH 6.0時(shí)，脫色率64.1%，pH 9.0時(shí)，脫色率78.3%。此后繼續(xù)增加pH至10.0時(shí)，脫色率幾乎保持不變。H2O2在水溶液中可電離出過(guò)氧氫根離子攻擊色素，且在堿性介質(zhì)中其電離度增大。因此，提高pH可增強(qiáng)雙氧水的脫色作用。多糖保留率則受pH影響較小，穩(wěn)定在71.9%～75.1%之間，故應(yīng)選擇pH為9.0較為適宜。見(jiàn)圖2。

圖1 脫色時(shí)間對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

圖2 脫色pH對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

2.3 脫色溫度對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

提高溫度可增加脫色率，因?yàn)楦邷乜杉涌熳杂苫碾x解，利于脫色。所以當(dāng)溫度從35℃升高至55℃時(shí)，脫色率提高了1.2倍，達(dá)到78.2%。但過(guò)高的溫度同時(shí)也會(huì)促進(jìn)自由基自身的分解，不利于脫色。所以，當(dāng)溫度超過(guò)55℃后，脫色率開(kāi)始降低。與此同時(shí)，多糖保留率幾乎不變，所以，綜合考慮應(yīng)選擇脫色溫度為55℃。見(jiàn)圖3。

圖3 脫色溫度對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

2.4 雙氧水用量對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

當(dāng)雙氧水用量5%時(shí)，脫色率40.8%，而雙氧水用量20%時(shí)，脫色率78.2%，提高了1.9倍。主要原因是當(dāng)雙氧水濃度較低時(shí)，分解速度較慢，因而脫色效果相對(duì)較差。但繼續(xù)增加雙氧水的用量，脫色率變化不大，與此同時(shí)多糖保留率迅速降低，因過(guò)量的雙氧水會(huì)導(dǎo)致多糖的氧化降解。因此，應(yīng)選擇雙氧水的用量為20%較為適宜。

圖4 雙氧水用量對(duì)貓爪草多糖脫色效果的影響

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析如表2、3所示，可知對(duì)貓爪草多糖雙氧水脫色率影響大小的順序?yàn)椋弘p氧水用量>脫色時(shí)間>脫色溫度 ，但三個(gè)因素中只有雙氧水用量對(duì)貓爪草多糖脫色率影響顯著(P<0.05)。最優(yōu)工藝組合為A1B1C3，即脫色時(shí)間60 min、脫色溫度45 ℃、雙氧水用量25%。但由單因素考察可知，雙氧水用量達(dá)25%時(shí)，多糖保留率降低，因此,綜合考慮脫色率與多糖保留率，選擇雙氧水用量為20%。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

為驗(yàn)證雙氧水脫色工藝的穩(wěn)定性和可信度，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3組平行試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，且多糖保留率相對(duì)較高，表明該脫色工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

目前，常用的多糖脫色方法包括吸附法、化學(xué)法、離子交換法等。龔敏等[5]采用大孔樹(shù)脂對(duì)藥桑多糖脫色后發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性有所增強(qiáng)；蔣俊等[6]報(bào)道了猴頭菌大孔樹(shù)脂脫色多糖對(duì)胃黏膜的損傷修復(fù)作用顯著提高；但肖平等[7]用活性炭對(duì)板藍(lán)根多糖脫色后發(fā)現(xiàn)其清除自由基的能力降低。因此，脫色方法的選擇除考慮脫色率、多糖保留率以外，還應(yīng)評(píng)估其對(duì)多糖結(jié)構(gòu)與活性的影響。

本文采用雙氧水對(duì)貓爪草多糖進(jìn)行脫色，考察了脫色時(shí)間、pH、脫色溫度、雙氧水用量對(duì)脫色率及多糖保留率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，雙氧水用量對(duì)脫色率有顯著影響，在脫色時(shí)間60 min、pH 9.0、脫色溫度45℃、雙氧水用量20%的條件下，貓爪草多糖的雙氧水脫色率為79.7%，多糖保留率為74.3%。但雙氧水為強(qiáng)氧化劑，從單因素考察可知其可能導(dǎo)致多糖氧化降解，故下一步將結(jié)合多糖的結(jié)構(gòu)分析與活性研究，更為深入地探討雙氧水的脫色影響。