(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，日照 276826)

在體內(nèi)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)于生物體來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，而該平衡的維持主要依靠泛素蛋白質(zhì)酶系統(tǒng)[1]以及自噬-內(nèi)溶酶體系統(tǒng)[2]。在泛素蛋白酶系統(tǒng)中，泛素通過(guò)泛素激活酶、結(jié)合酶和連接酶的作用結(jié)合到蛋白質(zhì)底物上，作為蛋白降解的標(biāo)志被28S蛋白酶復(fù)合體所識(shí)別啟動(dòng)蛋白質(zhì)的降解[1]。除了參與蛋白降解外，泛素化修飾也是生物體蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要形式，幾乎在所有功能細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮著重要的作用，這些作用包括蛋白質(zhì)降解，DNA損傷反應(yīng)，應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3]。

泛素最初是從牛胸腺中分離出來(lái)，隨后發(fā)現(xiàn)泛素高度保守，普遍存在于從原生動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的活細(xì)胞中，由分子量為8.4～8.5kDa的74～76個(gè)氨基酸殘基組成[4]。泛素研究主要集中于高等動(dòng)植物體內(nèi)，但是對(duì)于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的研究較少，目前僅在擬穴青蟹[5]、太平洋牡蠣[6]等物種中有所報(bào)道。單環(huán)刺螠屬于螠蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)，螠綱，無(wú)管螠目，刺螠屬，是居住在潮間帶和潮下帶U型洞穴的海洋無(wú)脊椎生物，也是無(wú)管螠目在我國(guó)存在的唯一物種[7]。本文以單環(huán)刺螠為研究對(duì)象，克隆單環(huán)刺螠泛素基因，分析其結(jié)構(gòu)特征及其器官分布規(guī)律，為單環(huán)刺螠泛素基因功能的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 單環(huán)刺螠購(gòu)買(mǎi)于山東省日照市石臼水產(chǎn)市場(chǎng)，產(chǎn)地為煙臺(tái)近海潮間帶，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通氣人工海水(18℃、pH 7.8和鹽度26)不投餌暫養(yǎng)。

1.1.2取樣 暫養(yǎng)3天后，挑取6只個(gè)體對(duì)體壁、肛門(mén)囊、中腸、后腸和體腔液進(jìn)行取樣，液氮凍存，-80℃長(zhǎng)期保存。

1.1.3儀器及試劑 試劑主要為T(mén)rizol(上海生工)、乙醇(國(guó)藥集團(tuán))、氯仿(國(guó)藥集團(tuán))、異丙醇(國(guó)藥集團(tuán))、瓊脂糖(上海生工)、Golden View(Solarbio)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primescript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Takara)和熒光定量試劑盒TB Green Premix Ex Taq(Takara)，引物由上海生工公司合成。

儀器主要為PCR儀(Biorad S100)、電泳儀(北京六一)、凝膠成像(Biorad GelDoc XR)和熒光定量PCR儀(Biorad CFX Connect)。

1.2 方法

1.2.1RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取單環(huán)刺螠器官mRNA，將0.1 g組織加入1ml Trizol溶液中，電動(dòng)勻漿器勻漿，根據(jù)Trizol說(shuō)明書(shū)的步驟提取RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。隨后根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primescript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)說(shuō)明書(shū)的流程反轉(zhuǎn)錄RNA，獲得cDNA。

1.2.2單環(huán)刺螠泛素基因的克隆及分析 利用太平洋牡蠣泛素基因(注冊(cè)號(hào)：JQ030888)在單環(huán)刺螠轉(zhuǎn)錄組(注冊(cè)號(hào)：SRA122323)中進(jìn)行BLAST搜索，獲得單環(huán)刺螠泛素的相似序列，隨后利用開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)finder確定序列的ORF，設(shè)計(jì)ORF驗(yàn)證引物(表1)進(jìn)行PCR，模板1μl，2 × PCR Mix 5μl(上海生工)，正向引物(2μM)4μl，反向引物(2μM)4μl，水6μl，總體積為20μl?；靹螂x心后，行PCR擴(kuò)增，96℃預(yù)變性10 min；96℃ 30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。隨后對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證。確定后利用NCBI查找其他物種泛素基因序列，利用CLUSTAL X2對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得其保守序列；利用MEGA 7軟件采用鄰位相連法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)化分析。

1.2.3單環(huán)刺螠泛素基因表達(dá)分析 利用qRT-PCR對(duì)單環(huán)刺螠泛素基因在各個(gè)器官中的表達(dá)分布規(guī)律進(jìn)行分析。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板利用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒(Takara)行在進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，2×TB Green Premix Ex Taq 10μl、正、反向引物(2mM)各4μl，模板2μl。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火延伸1min，40個(gè)循環(huán)；隨后進(jìn)行溶解曲線反應(yīng)驗(yàn)證產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性。β-actin作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt方法來(lái)確定目的基因的相對(duì)表達(dá)。引物見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 單環(huán)刺螠泛素基因的克隆

利用已知的與單環(huán)刺螠在進(jìn)化上關(guān)系最近的太平洋牡蠣泛素基因在單環(huán)刺螠轉(zhuǎn)錄組中進(jìn)行BLAST獲得單環(huán)刺螠泛素序列，全長(zhǎng)500 bp，利用ORF Finder發(fā)現(xiàn)其ORF在37～270位點(diǎn)，長(zhǎng)度234 bp，利用設(shè)計(jì)的ORF引物(表1)行PCR驗(yàn)證，其電泳結(jié)果如圖1所示，PCR后獲得單一條帶，大小在250 bp左右，與預(yù)測(cè)大小基本一致，測(cè)序公司測(cè)序確定結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

其序列特征如圖2所示，序列全長(zhǎng)500 bp，ORF長(zhǎng)度234 bp，編碼76個(gè)氨基酸，分子式C382H638N106O119S1，含有1246個(gè)原子，相對(duì)分子質(zhì)量為8651.97，等電點(diǎn)是6.56。

圖1 單環(huán)刺螠泛素ORF驗(yàn)證

2.2 單環(huán)刺螠泛素基因序列保守性及進(jìn)化分析

利用多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠的泛素基因序列與其他物種的泛素基因具有高度的一致性，僅僅只有C端的一個(gè)氨基酸序列不同(圖3)。根據(jù)其多序列比對(duì)結(jié)果利用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，單環(huán)刺螠與無(wú)脊椎動(dòng)物聚為一枝，再與高等脊椎動(dòng)物聚為一枝，與進(jìn)化關(guān)系基本保持一致。見(jiàn)圖4。

圖2 單環(huán)刺螠泛素基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 泛素序列比對(duì)分析圖

圖4 泛素進(jìn)化分析

2.3 單環(huán)刺螠泛素基因在各器官中表達(dá)特征

分析單環(huán)刺螠泛素基因在單環(huán)刺螠各個(gè)器官中的表達(dá)規(guī)律，體腔液中表達(dá)量最低，其次是腸道，后腸的表達(dá)量是體腔液的2.39倍，中腸是2.78倍，然后是體壁，表達(dá)量是體腔液表達(dá)量的3.46倍，而肛門(mén)囊表達(dá)量最高，達(dá)到體腔液表達(dá)量的4.55倍。除體腔液外，其他器官中泛素基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

注：與體腔液泛素基因mRNA相比，*P<0.05。

3 討論

泛素蛋白質(zhì)酶系統(tǒng)一直是生物科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，泛素蛋白與目標(biāo)蛋白的共價(jià)結(jié)合介導(dǎo)蛋白的選擇性降解是泛素參與的經(jīng)典途徑，這一途徑廣泛存在于真核生物中[8]。因此，為了維持功能的穩(wěn)定，泛素基因序列從高等無(wú)脊椎動(dòng)物到低等的真菌具有高度的保守性，例如人和酵母的泛素基因僅有3個(gè)氨基酸殘基的差別[9]。本研究克隆得到的單環(huán)刺螠泛素基因蛋白質(zhì)序列與其他物種的序列也具有極高的保守性，僅僅在C端存在著一個(gè)氨基酸的不同，這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明泛素基因在生物進(jìn)化過(guò)程中具有相同的祖先，而且進(jìn)化過(guò)程中為了維持功能的穩(wěn)定，序列幾乎不發(fā)生變異，從另外角度也證明了其功能的重要性。

單環(huán)刺螠泛素基因在各器官中廣泛存在，而且除體腔液外在其他器官中的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果恰好與泛素基因的名字在各組織中廣泛存在相對(duì)應(yīng)，這也與擬穴青蟹中泛素在各器官中的分布規(guī)律一致[5]。但是泛素基因在精卵發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著性的變化，例如在小鼠精原細(xì)胞中含量很低，精母細(xì)胞含量開(kāi)始升高，到達(dá)精子表達(dá)量最高[10]。對(duì)于單環(huán)刺螠來(lái)說(shuō)，其體腔液中會(huì)存在大量生殖細(xì)胞[11-12]，這會(huì)導(dǎo)致泛素基因的相對(duì)表達(dá)量改變。此外，泛素參與的非經(jīng)典途徑參與多種生理生化反應(yīng)，在低等的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中，泛素具有抗菌的特性[6]，單環(huán)刺螠泛素的功能需要進(jìn)一步的研究。