程國軍，謝 婧，殷 杰，彭 楊

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

谷胱甘肽還原酶(GshR)是一個(gè)約為125 kDa的蛋白質(zhì)，廣泛存在于細(xì)胞核、線粒體、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在保護(hù)生物體方面起關(guān)鍵作用[2].GshR是依賴NADPH的氧化還原酶家族的一員，是在抗壞血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循環(huán)中作為ROS解毒至關(guān)重要的抗氧化酶.高效的GshR可維持細(xì)胞中GSH/GSSH處于高值，對(duì)GSH抗氧化劑的功能非常重要[3].Ku M等[4]發(fā)現(xiàn)白色念珠菌gshR基因突變株喪失硫氧還蛋白1、2的基因活性，細(xì)胞成絲情況、抗氧化性質(zhì)及丙酮醛含量明顯下降，以致無法存活.將谷胱甘肽還原酶編碼基因?qū)氪竽c桿菌后轉(zhuǎn)入載體，在H2O2環(huán)境下表達(dá)的GshR融合蛋白活性高于自然條件下4倍，表明GshR蛋白在機(jī)體處于不利環(huán)境時(shí)有解毒作用.李智燕等[5]對(duì)天藍(lán)苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌CAT(過氧化氫酶)、GshR等抗氧化酶系研究表明在高濃度鋁作用下，GshR失去防御能力而被破壞，活性降低.馬占強(qiáng)等[6]人對(duì)苜蓿中華根瘤菌Sinorhizobiummeliloti研究表明該菌株可通過提高SOD(超氧化物歧化酶)、GshR等酶的活性，降低銅離子的毒害效應(yīng).Muglia C等[7]構(gòu)建了熱帶根瘤菌RhizobiumtropiciGSH合成酶基因缺失突變株，該突變株接種菜豆宿主，形成低固氮活性的不正常根瘤.

豌豆根瘤菌3841gshR基因編碼谷胱甘肽還原酶，本文通過構(gòu)建豌豆根瘤菌gshR基因突變株，進(jìn)一步研究谷胱甘肽還原酶基因突變對(duì)根瘤菌抗氧化以及共生固氮的影響，為闡明谷胱甘肽還原酶在根瘤菌抗氧化體系中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株為野生型豌豆根瘤菌RL3841和大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，RLgshR為本次試驗(yàn)構(gòu)建的RL3841突變體，克隆載體 pK19mob由英國牛津大學(xué)Philip S Poole教授提供.甜豌豆種子為本實(shí)驗(yàn)室保存.大腸桿菌用LB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)，豌豆根瘤菌用AMS或TY培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng).豌豆根瘤菌培養(yǎng)所用抗生素(Sigma)及濃度：新霉素(Neo)80 μg/mL,鏈霉素(Str)500 μg/mL,壯觀霉素(spe) 100 μg/mL；大腸桿菌培養(yǎng)所用抗生素及濃度：四環(huán)素(Tc)5 μg/mL,卡那霉素(Km)20 μg/mL.

限制性內(nèi)切酶(XbaI、BamH I、Hind III等)、T4 DNA連接酶、RNAiso Plus、限制性內(nèi)切酶均購于TaKaRa公司；TaqDNA 聚合酶、phusion 高保真酶購于Thermo Scientific公司；PCR產(chǎn)物及DNA凝膠回收試劑盒等購于博大泰克公司；反轉(zhuǎn)錄所用試劑為 PrimeScriptTMRT reagent Kit,FastStart Universal SYBR Green Master (Rox).

1.2 RLgshR突變菌株的構(gòu)建

構(gòu)建gshR基因突變株參照田夢(mèng)洋等[8]方法，以RL3841總DNA為擴(kuò)增模板，gshR的上游和下游引物(見表1)進(jìn)行PCR反應(yīng).將pK19mob載體與目的片段分別用XbaI和Hind III雙酶切后，經(jīng)T4 DNA連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)檢測后，獲得陽性重組轉(zhuǎn)化子pKgshR.再進(jìn)行三親本結(jié)合實(shí)驗(yàn)，其中RL3841為受體菌，大腸桿菌pKgshR為供體菌，大腸桿菌pRK2013為輔助菌，通過抗生素平板及以M13/RLgshRMP為引物的 PCR驗(yàn)證，最終獲得gshR基因突變菌株RLgshR.

表1 PCR引物序列

注：____為限制性酶切位點(diǎn)

1.3 菌株的生長試驗(yàn)

1.3.1 菌株的自由生長

將已活化的RLgshR與RL3841菌株接種于添加相應(yīng)抗生素的TY培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d后，用AMS培養(yǎng)基洗脫、重懸，使其初始D(600 nm)=0.01，30 ℃，200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，間隔取樣測其D(600 nm)，3組平行試驗(yàn).

1.3.2 抑菌試驗(yàn)

在BOTs的發(fā)病機(jī)理中，有兩條途徑被提出。 首先是涉及BRAF和KRAS突變的“低級(jí)”途徑。 根據(jù)這一途徑，漿液性卵巢囊腺瘤進(jìn)展為漿液性BOTs，最終通過連續(xù)的組織學(xué)前驅(qū)病變導(dǎo)致低度漿液性上皮性卵巢癌[4]。 所有漿液性BOTs中只有2%通過這種“低級(jí)”途徑進(jìn)展至癌癥。 其次是涉及p53基因突變的“高級(jí)”途徑。 大多數(shù)漿液性卵巢癌屬于這種高級(jí)途徑，沒有已知的前體。 血清BOTs可以抑制SERPINA 5和雙特異性磷酸酶4DUSP4兩種基因的活化，而它們實(shí)質(zhì)上是由細(xì)胞外基質(zhì)降解的特異性腫瘤抑制基因，這是侵襲性生長發(fā)病的關(guān)鍵因素[5]。

使用處于對(duì)數(shù)生長期的RLgshR和RL3841菌株，用蒸餾水洗脫，使菌懸液D(600 nm)=1，涂布于AMS培養(yǎng)基平板，待平板晾干后，分別將含有不同濃度的氫過氧化枯烯(CuOOH)、雙氧水(H2O2)濾紙片置于平板中央，30 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，3組平行試驗(yàn).CuOOH溶于95%無水乙醇，以潤有95%無水乙醇的圓濾紙片作為對(duì)照.

1.4 熒光定量RT-PCR

將活化的RL3841接種于AMS液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)D(600 nm)=0.3～0.6，每種菌3個(gè)重復(fù).菌體離心收集后，用0.5 mmol/L H2O2處理1 h，對(duì)照組用生理鹽水處理.采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再對(duì)cDNA模板進(jìn)行熒光定量PCR.gshR基因熒光定量PCR的引物見表1，gyrB1為內(nèi)參基因.

類菌體RNA提取時(shí)，將培養(yǎng)25 d的豌豆植株摘取根瘤放置于研缽中，加入液氮，研磨至粉狀，其后續(xù)RNA提取和cDNA制備等步驟與細(xì)菌RNA提取相同.其中對(duì)照組為無H2O2處理的AMS自生培養(yǎng)中對(duì)數(shù)期的3841菌株.gyrB1為內(nèi)參基因，對(duì)類菌體中g(shù)shR基因進(jìn)行熒光定量分析.

1.5 植物盆栽試驗(yàn)

采用蛭石作為基質(zhì)種植甜豌豆[8].將實(shí)驗(yàn)室保存的甜豌豆經(jīng)95%乙醇、2%次氯酸鈉水溶液表面消毒后，無菌水清洗播種于已滅菌并含有營養(yǎng)液的蛭石塑料燒杯中，每杯3顆豌豆，每種菌種3組重復(fù)，在每顆豌豆上接種1 mL相應(yīng)的菌懸液.播種完畢后用蛭石掩埋、保鮮膜封口，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).控制培養(yǎng)條件：22 ℃、濕度70%、光照培養(yǎng)16 h；20 ℃、濕度70%，黑暗培養(yǎng) 8 h .盆栽1 周后，待幼苗生長，用無菌牙簽將保鮮膜挑破，讓幼苗長出，定期添加營養(yǎng)液.4周后利用乙炔還原法測量根瘤固氮酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 RLgshR突變菌株的構(gòu)建

按照程國軍等[9]突變體構(gòu)建的方法，在含有鏈霉素和新霉素的抗性平板上長出單菌落.以利用M13/RLgshRMP為引物，對(duì)重組子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增出約650 bp的基因片段，得到gshR目的基因突變株RLgshR.

2.2 gshR基因突變對(duì)菌株生長的影響

將已活化的RLgor與RL3841菌株以初始D(600 nm)為0.01接種于AMS液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，間隔取樣測其D(600 nm)，每個(gè)菌株3次重復(fù)，并繪制生長曲線(見圖1).

圖1 野生型3841菌株與RLgshR菌株在AMS培養(yǎng)基中的生長情況Fig.1 Growth curves of wild type 3841 and RLgshR strain in AMS medium

由圖1可知：RLgshR與RL3841菌株的生長變化趨勢(shì)相同.經(jīng)顯著性方差分析，兩種菌株在細(xì)菌數(shù)量增長上無顯著差異，說明gshR基因突變不影響豌豆根瘤菌的正常生長.

2.3 gshR基因突變對(duì)菌株抗氧化物能力的影響

2.3.1gshR基因突變對(duì)根瘤菌抗H2O2的影響

無機(jī)氧化物H2O2對(duì)gshR基因突變株的抑菌能力結(jié)果見表2.當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L時(shí)，RLgshR和RL3841的抑菌圈直徑無顯著差異；但當(dāng)H2O2濃度分為100，500，1000 mmol/L時(shí)，RLgshR的抑菌圈的直徑分別為10.87，17.60，21.53 cm，顯著大于RL3841的抑菌圈直徑(P<0.05)，說明gshR基因突變雖不會(huì)影響豌豆根瘤菌抗低濃度H2O2的能力，但會(huì)嚴(yán)重影響其對(duì)較高濃度H2O2的抗性.

表2 不同濃度H2O2作用下RL3841和RLgshR的抑菌圈直徑

Tab.2 Inhibition zone diameters of RL3841 and RLgshR under different concentrations of H2O2

c(H2O2)/(mmol·L-1)抑菌圈直徑 / cmRL3841RLgshR203.40±0.404.07±0.211006.53±0.3510.87±0.38*50013.57±0.3517.60±0.46*100018.63±0.4021.53±0.42*

*與野生株RL3841相比，P<0.05

2.3.2gshR基因突變對(duì)根瘤菌抗CuOOH的影響

有機(jī)氧化物H2O2對(duì)gshR基因突變株的抑菌能力結(jié)果見表3.當(dāng)CuOOH濃度分別為5，20，100，500 mmol/L，突變株RLgshR抑菌圈直徑分別為3.50,8.50,15.17,18.50 cm，均顯著大于RL3841的抑菌圈直徑(P<0.05),表明gshR基因突變會(huì)嚴(yán)重影響根瘤菌抗有機(jī)氧化物CuOOH的能力.

表3 不同濃度CuOOH作用下RL3841和RLgshR菌株的抑菌圈直徑

Tab.3 Inhibition zone diameters of RL3841 and RLgshR under different concentrations of CuOOH

c(CuOOH) / mmol·L-1抑菌圈直徑 / cmRL3841RLgshR52.30±0.663.50±0.30*205.73±0.478.50±0.78*10011.77±0.8115.17±0.50*50015.40±0.5618.50±0.79*

*與野生株RL3841相比，P<0.05

2.4 植物盆栽試驗(yàn)

盆栽4周后，gshR基因突變株RLgshR接種豌豆植株形成紅色有效根瘤.將培養(yǎng)4周的豌豆植株利用乙炔還原法測定根瘤固氮酶活(見圖2 ).結(jié)果表明gshR基因突變對(duì)根瘤菌的共生表型和共生酶活無顯著影響.

2.5 熒光定量RT-PCR分析gshR基因的表達(dá)量

用0.5 mmol/L H2O2處理 1 h，豌豆根瘤菌3841gshR基因的表達(dá)量為生理鹽水對(duì)照組表達(dá)量的0.96±0.69倍；其在形成25 d根瘤類菌體中表達(dá)量為在自生條件下的1.26±0.17倍，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，gshR基因表達(dá)無顯著差異，說明gshR基因的表達(dá)不受H2O2和共生環(huán)境的誘導(dǎo).

圖2 RLgshR和RL3841的共生固氮酶活Fig.2 Symbiotic nitrogenase activity of RLgshR and RL3841

3 討論

ROS可與氧化應(yīng)激反應(yīng)，無靶向性作用于脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA以誘導(dǎo)病理反應(yīng).豆科植物根瘤細(xì)胞已進(jìn)化出防御系統(tǒng)，可維持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)并減輕氧化應(yīng)激所造成的損害[10]，谷胱甘肽還原酶能將氧化型谷胱甘肽(GSSG) 還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，是活性氧的清除提供重要的還原力[7].本研究發(fā)現(xiàn)：豌豆根瘤菌gshR基因編碼谷胱甘肽還原酶，該基因突變對(duì)根瘤菌RL3841的生長無影響，但是對(duì)有機(jī)氧化物CuOOH和較高濃度的無機(jī)氧化物H2O2十分敏感.在白念珠菌Candidaalbicans[4]、E.coil等細(xì)菌中，谷胱甘肽還原酶已被證明在抗氧化、機(jī)體解毒方面有重要作用.在乳酸乳球菌LactococcuslactisSK11[11]中發(fā)現(xiàn)菌株經(jīng)H2O2處理，其死亡率高出自然條件下正常菌株的5.6倍.Riccillo P M等[12]研究發(fā)現(xiàn)熱帶根瘤菌R.tropici谷胱甘肽合成酶基因突變會(huì)顯著降低根瘤菌抗酸和氧化物能力.經(jīng)H2O2處理，野生型菌株3841中g(shù)shR基因的表達(dá)量無顯著變化，說明gshR的表達(dá)不受外界H2O2的誘導(dǎo).Soo J S等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將Tigriopusjaponicus置于不用濃度的H2O2溶液中處理1 h，谷胱甘肽還原酶編碼基因的表達(dá)量并無顯著差異.

已有研究說明根瘤菌谷胱甘肽缺失突變會(huì)顯著降低根瘤固氮酶活[7].但本研究中豌豆根瘤菌gshR基因缺失對(duì)植物共生和根瘤菌固氮酶活均無影響，由于其他抗氧化系統(tǒng)對(duì)缺失有補(bǔ)償作用，如CAT酶、過氧化氫酶氧化應(yīng)激系統(tǒng)可彌補(bǔ)細(xì)胞缺失GSH所造成的不足.