顏 衛(wèi),丁立軍,盧勁曄,沈曉鵬,周媛麗

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 ,江蘇 泰州 225300）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.monocytogenes）是一種兼性胞內(nèi)寄生菌,可引起人和多種家畜家禽的李斯特菌病。該病發(fā)病率低,致死率達(dá)到20% ～30%。易感人群主要為孕婦、新生兒、老年人、免疫力低下人群,會出現(xiàn)流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥及多器官功能障礙等。動物李斯特菌病以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染為主,初期有精神沉郁、食欲不振、發(fā)熱等癥狀,幾天后會出現(xiàn)腦膜炎癥狀。動物的發(fā)病主要與食用污染的飼料有關(guān),病原菌經(jīng)過污染農(nóng)場、食品加工、銷售傳染給人。李斯特菌病在歐美國家曾多次暴發(fā)流行,我國也有L.monocy togenes在畜禽和人之間暴發(fā)的報(bào)道[1]。作為四大食源性病原菌之一,從食物、人群、動物3個維度對產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的流行現(xiàn)狀進(jìn)行監(jiān)測,及時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑 李斯特增菌培養(yǎng)基,購自BD公司;李斯特選擇培養(yǎng)基OXFORD、純培養(yǎng)基BHI,均購自 OXOID 公司;Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA Marker,購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 樣品來源 2016年8月-2017年7月在江蘇泰州地區(qū)采集醫(yī)院病人腦脊液樣品、豬場和羊場動物樣品、超市、農(nóng)貿(mào)市場、餐飲店食品樣品共946份進(jìn)行單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測。棉拭樣品用Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基,其余樣品置于4℃冰盒6 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.3 L.monocytogenes的分離 Carry-Blair培養(yǎng)基中取出的棉拭樣本、食品類固體樣本1 g剪碎、液體樣本1 mL,加入9 mL增菌培養(yǎng)基LEB中培養(yǎng)24 h,挑取增菌液劃線接種于選擇培養(yǎng)基OXFORD上培養(yǎng)24 h,選擇疑似菌落（細(xì)小、濕潤、黑色）接種純培養(yǎng)基BHI,過夜培養(yǎng),菌液用溶菌酶-蛋白酶K法提取基因組DNA,具體步驟為:250 μL菌液13 000 r/min離心10 min,上清液棄去,菌體用95 μL Buffer混勻后加入4 μL溶菌酶（50 mg/mL）孵育15 min,再加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL）稍許震蕩后58℃孵育至菌液澄清,95℃加熱8 min后離心取上清液進(jìn)行PCR檢測。

1.4 L.monocytogenes的鑒定 參照周曉輝的方法[2],以L.monocytogenes的毒力基因溶血素基因hly下游片段設(shè)計(jì)引物,PCR體系中各成分的量為:10 × Buffer 2.5 μL,MgCl21.5 μL,dNTPs 5 pmol/L,hly引物各 10 pmol/L,模板 DNA 3 μL,Taq酶0.2 μL,去離子水14.8 μL。 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃2 min,95℃10 s,60℃30 s,72℃30 s,35個循環(huán),72℃ 10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,成像儀上觀察結(jié)果,在850 bp處出現(xiàn)特異性條帶的為單核細(xì)胞增生性李斯特菌陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 腦脊液樣本L.monocytogenes的監(jiān)測結(jié)果 從醫(yī)院患者的腦脊液樣本24份中未分離到L.monocytogenes。

2.2 動物源樣本L.monocytogenes的監(jiān)測結(jié)果 從動物養(yǎng)殖場采集樣本263份,分離到L.monocytogenes 4株,陽性率1.52%。豬場健康豬鼻腔棉拭樣本、肛拭樣本87份,陽性樣本1份,L.monocytogenes污染率1.15%;豬場環(huán)境樣本61份,分離到 L.monocytogenes 1株,陽性率1.64%;羊場健康羊鼻腔棉拭樣本、肛拭樣本73份,陽性樣本1份,L.monocytogenes污染率1.37%;羊場環(huán)境樣本42份,分離到L.monocytogenes 1株,陽性率2.38%。

2.3 食源樣本L.monocytogenes的監(jiān)測結(jié)果 從農(nóng)貿(mào)市場、超市和包括鹵菜店、飲品店在內(nèi)的餐飲店采集食物樣本659份,分離到L.monocytogenes 26株,陽性率為3.95%。其中肉制品為采集自市場和超市的豬肉、牛肉、雞肉,共137份,L.monocytogenes檢出率12.41%;水產(chǎn)品樣本包括來源于市場、超市的淡水魚、蝦、海水魚177份,L.monocytogenes檢出率2.26%;冷凍魚糜制品包括火鍋、麻辣燙食品中經(jīng)常食用的魚丸、蝦丸、蟹肉棒58份,采集自超市,檢出率1.72%;采集自鹵菜店的熟肉制品包括消費(fèi)者經(jīng)常購買的豬肉、豬舌頭、豬耳朵、鵝肉、雞肉 51份,L.monocytogenes檢出率3.92%;涼拌菜52份,分離率1.92%;通過現(xiàn)場、電話、網(wǎng)絡(luò)訂餐方式采集的外賣盒飯樣品44份,分離到1株 L.monocytogenes,陽性率2.27%;蔬菜、乳制品、果汁中未檢測到L.monocytogenes,具體數(shù)據(jù)如表1。

表1 不同食物樣品L.monocytogenes監(jiān)測結(jié)果

依據(jù)采樣地點(diǎn)不同,659份食物樣品分別來源于農(nóng)貿(mào)市場、超市和餐飲服務(wù)場所,包括針對不同消費(fèi)群體的鹵菜店、飲品店、快餐小吃店、餐館等,L.monocytogenes檢出率如表2,檢出率最高的為市場樣品,236樣品中分離到L.monocytogenes15株,陽性率6.36%;其次為超市樣品,240份中陽性樣品7份,陽性率2.92%;183份餐飲樣品分離到L.monocytogenes4株,陽性率2.19%。

表2 不同采樣地點(diǎn)L.monocytogenes檢出情況

采集的10類食品分為即食食品和非即食食品兩大類,其中即食食品包括熟肉制品、涼拌菜、乳制品、果汁、外賣盒飯5類;非即食食品包括生畜禽肉、淡水魚蝦、海魚、冷凍魚糜、蔬菜5類。表3結(jié)果顯示221份即食食品中L.monocytogenes檢出率為1.81%,438份非即食食品中L.monocytogenes檢出率為5.02%,非即食食品的L.monocytogenes檢出率高于即食食品。

表3 即食食品和非即食食品L.monocytogenes檢出情況

不同季度樣品的監(jiān)測結(jié)果見表4,4個季度均有L.monocytogenes陽性樣品檢出,檢出率依次為2.42% 、3.62% 、5.05% 、3.91% 。

表4 不同季度樣品中L.monocytogenes檢出情況

3 討論

本試驗(yàn)?zāi)X脊液樣本未分離到L.monocytogenes,這與樣品采集范圍不廣,樣品量不夠大有關(guān),此外,目前國內(nèi)人群李斯特菌病多為散發(fā),免疫功能低下者多表現(xiàn)為中樞感染,孕婦多見局灶感染,且感染的原因多為食源性的,可通過胎盤、產(chǎn)道感染胎兒,引起新生兒化膿性腦膜炎、敗血癥等。健康人群感染L.monocytogenes后,病原菌主要在肝細(xì)胞增殖,最終被T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答清除[3]。感染的確診有賴于血液、腦脊液等的微生物學(xué)檢測,早期選擇有效的抗生素,如氨芐西林或大劑量青霉素[4],也可選用萬古霉素、碳青霉烯類等可以改善預(yù)后,降低死亡率。

L.monocytogenes在自然界廣泛存在,多種動物均可感染,其中豬感染病例報(bào)道較多,其次為羊。本研究在健康豬群、羊群、環(huán)境中均分離到L.monocytogenes,雖然未發(fā)生動物疫情,但環(huán)境中的致病菌對動物群仍構(gòu)成威脅,是引起疫病的隱患。動物李斯特菌病的發(fā)生主要與食用污染的貯存飼料有關(guān),霉變、低酸度劣質(zhì)青貯是L.monocytogenes的主要貯存場所,往往會引發(fā)羊群暴發(fā)李斯特菌病。試驗(yàn)中采樣的養(yǎng)殖場飼料質(zhì)量過關(guān),羊群飼喂干草。提高飼料質(zhì)量,減少動物群密度,保障動物一定量的運(yùn)動,同時(shí)按操作規(guī)程加強(qiáng)養(yǎng)殖場環(huán)境管理,定期消毒是保證動物群健康的有效措施。

食源樣本中L.monocytogenes污染率為3.95%,10類食品中生畜禽肉的陽性率最高,達(dá)到12.41%,說明在畜禽屠宰、加工、銷售環(huán)節(jié)還需要進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)管。首先從宰前飼養(yǎng)環(huán)境抓起,環(huán)境的定期消毒非常重要。生產(chǎn)過程中畜禽胴體產(chǎn)品和腸道產(chǎn)品可采取分開處理的方式,控制內(nèi)臟沖洗對胴體和環(huán)境的污染,肉品保存的冷庫環(huán)境也不容忽視,與其他食源性人獸共患病原菌不同,L.monocytogenes對生存溫度要求廣泛,低溫下仍生長良好,這一特性提示了冷庫肉品也有被污染的可能。流通環(huán)節(jié)的自然環(huán)境、污水、切割器具、接觸器皿、被污染的其他生熟食品都是造成或加重肉制品污染L.monocytogenes的原因。水產(chǎn)品中淡水魚蝦污染率1.90%、海魚污染率2.78%,可能是由于冷藏運(yùn)輸過程中L.monocytogenes增殖或發(fā)生二次污染。冷凍魚糜制品（魚丸、蝦丸、蟹肉棒等）污染率1.72%的原因有3個方面:（1）原料即水產(chǎn)品的污染;（2）加工過程的污染,經(jīng)過切割、絞碎、攪拌等步驟,設(shè)備、人員、環(huán)境會造成交叉污染,運(yùn)輸、銷售過程也會受到人員污染;（3）存貯溫度不達(dá)標(biāo),存在敞口銷售、反復(fù)凍融等現(xiàn)象,未按照標(biāo)準(zhǔn)全程冷鏈。即食食品的污染率1.81%,提示在食品加工過程中要嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行操作,生熟食分開,同時(shí)生熟食的加工用具也要分開。目前,全國范圍內(nèi)餐飲即食食品的微生物標(biāo)準(zhǔn)正在制定,江蘇已經(jīng)建立了相關(guān)的地方標(biāo)準(zhǔn)[5]。試驗(yàn)監(jiān)測到熟肉制品L.monocytogenes污染率達(dá)到3.92%,熟肉制品的銷售過程基本開放,銷售時(shí)間較長,有的鹵菜攤點(diǎn)不防塵、無消毒、無冷藏,這些都會造成食物的二次污染,引起致病菌的增殖。從外賣盒飯中分離到L.monocytogenes說明餐飲店還需要從原料監(jiān)管、設(shè)施管理、人員培訓(xùn)、衛(wèi)生安全意識強(qiáng)化等方面著手進(jìn)一步提高食品安全管理水平,同時(shí)需要加強(qiáng)對網(wǎng)絡(luò)訂餐平臺的運(yùn)營監(jiān)管。不同采樣地點(diǎn)的檢出情況比較顯示,市場檢出率最高6.36%,這與衛(wèi)生條件、儲藏條件相對較差、人口密集有關(guān),需要加大對市場的監(jiān)管力度,提高個體經(jīng)營者的食品衛(wèi)生安全意識,定期進(jìn)行衛(wèi)生知識培訓(xùn)。