牛津杯法測定抗菌肽對四種有害微生物的抑制效果

■周 芳 熊海濤 張 江 柳永剛 宋 凱*

（1.集美大學水產(chǎn)學院，福建廈門361021；2.廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，福建廈門361021；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京100000；4.林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，河南林州456500）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）與副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）都是嗜鹽性革蘭氏陰性菌，隸屬弧菌科、弧菌屬，廣泛分布于海水及河口處，均是海水魚類的主要病原菌，在世界范圍內(nèi)對海水魚類養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[1-2]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科，氣單胞菌屬，是氣單胞菌的一種，廣泛分布于池水、淤泥、土壤環(huán)境中，可感染兩棲類、爬行類、鳥類等動物，同時也是多種水產(chǎn)動物的致病菌，能引起腹瀉和敗血癥[3-4]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人類化膿感染中最常見的革蘭氏陽性菌，也是最常見的食源性致病菌之一[5]?？咕模ˋntimicrobial peptides,Amps）是生物體內(nèi)經(jīng)誘導產(chǎn)生的一類具有抗菌生物活性的小分子短肽，廣泛來源于植物、動物、微生物中，因其具有殺菌高效性、廣譜性和不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點而被廣泛使用，僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞以及某些病毒，在動植物病害防治方面也日益受到人們關注[6]?？咕南啾容^其他化學藥物或抗生素作為水產(chǎn)飼料添加劑有著廣泛的應用前景，目前抗菌肽對這四種水產(chǎn)動物病原菌的抑制作用的研究尚比較少，本試驗采用牛津杯法來測定該抗菌肽對金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌的抑菌效果，以期為抗菌肽作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖領域的廣泛使用提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 指示菌

副溶血弧菌(V.parahaenzolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)由集美大學水產(chǎn)學院病理實驗室從感染這兩種弧菌的凡納濱對蝦體內(nèi)分離得到。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）由集美大學水產(chǎn)學院營養(yǎng)與飼料教研室提供。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923由林州中農(nóng)穎泰有限公司提供。

1.1.2 指示菌培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

1.1.3 抑菌物質(zhì)和抑菌懸液配制

稱取0.512 g粉末狀抗菌肽溶入5 ml無菌雙蒸餾水中，制成102.4 mg/ml的抗菌肽母液，37℃下超聲波處理15～20 min。靜置數(shù)分鐘，然后采用2倍梯度稀釋，配制成 51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/ml的樣品溶液，調(diào)整pH為7.0～8.0，分別編號1～9，4℃保存待用。每種濃度各取0.2 ml用于對四種指示菌的最小抑菌濃度（MIC）的測定，每種濃度四個重復處理。

1.1.4 主要試劑和器材

胰蛋白胨(北京陸橋技術有限公司)、瓊脂粉(上海捷瑞生物工程有限公司)、酵母提取物(英國OXOID),氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)等，生化培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司），牛津杯內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

往100 ml LB液體培養(yǎng)基分別接種副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌各100 μl后于37℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，進行第一次活化；分別取第一次活化好的四種菌液5 ml于已裝有200 ml液體培養(yǎng)基的錐形瓶中進行第二次活化，方法同第一次。菌體第二次活化完成后用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋涂布法（稀釋成14個梯度，每個稀釋梯度6個重復處理）進行菌落計數(shù)。計算第二次活化后的菌液濃度并使金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌四種菌液濃度分別調(diào)整至3×1016、1.6×1014、7.5×105、8.5×105CFU/ml用于正式抑菌試驗。第二次活化的四種指示菌懸液在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 指示菌菌懸液的涂布

取第二次活化好的四種指示菌菌懸液100 μl在固體瓊脂平板上均勻涂布，用鑷子將無菌牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿，在水平放置的平皿中均勻地放置3個牛津杯，設置無菌水處理作為空白對照組，編號為0，9個濃度梯度的抑菌懸液編號為1～9，分別預先在培養(yǎng)皿邊緣做好編號標記，每個濃度梯度做四個重復處理。加入各個濃度梯度的抗菌肽懸液200 μl于相應編號的牛津杯中，注意不要將抗菌肽懸液加滿牛津杯，防止抗菌肽懸液溢出牛津杯外。

1.2.3 指示菌的培養(yǎng)和最小抑菌濃度（MIC）的測定將加入抗菌肽懸液的培養(yǎng)皿放置在恒溫生化培養(yǎng)箱中37℃條件下擴散24 h，抗菌肽懸液會向培養(yǎng)基內(nèi)呈球形擴散，指示菌同時在此條件下培養(yǎng)，并開始繁殖?？咕脑诃傊囵B(yǎng)基中的濃度，隨離開牛津杯的距離增大而降低，當擴散到一定時間后，瓊脂培養(yǎng)基抗菌肽的濃度恰好高于其對指示菌的最低抑菌濃度，而指示菌繁殖被抑制呈現(xiàn)出透明的抑菌圈，觀察抑菌圈大小，拍照并用游標卡尺測量其直徑大小，取平均值。此時抑菌圈邊緣處的抗菌肽的濃度可視為其對指示菌的最小抑菌濃度（MIC，Minimum Inhibitory Concentration），即能產(chǎn)生透明抑菌圈的最小抑菌劑濃度定為MIC，其判定標準為：在該濃度下抑菌圈直徑大于或等于8.0 mm[7]。

2 結(jié)果與討論

表1 牛津杯法測定不同質(zhì)量濃度抗菌肽的抑菌效果

由表1可知，抗菌肽對金黃色葡萄球菌（3×1016CFU/ml）、副溶血弧菌(1.6×1014CFU/ml)、溶藻弧菌（7.5×105CFU/ml）、嗜水氣單胞菌（8.5×105CFU/ml）的最小抑菌濃度分別是0.8、0.8、1.6、3.2 mg/ml?？咕膶瘘S色葡萄球菌的抑菌效果最好，其次是副溶血弧菌、溶藻弧菌，對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最弱，可知不同細菌對同一種抗菌肽的敏感性程度也不同。這與韓樹江[8]的研究結(jié)果“黃粉蟲抗菌肽對溶藻弧菌的抑制作用＞對副溶血弧菌的抑制作用＞對嗜水氣單胞菌的抑制作用”有差別。由表2和圖1可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著抗菌肽質(zhì)量濃度的增加，抑菌圈直徑在增加，說明抑菌作用在不斷增強。有研究表明[9-10]，抗菌肽相比較中草藥提取液及醇提液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果更明顯。劉付弟[11]的研究結(jié)果表明，抗菌肽SThanatin對金黃色葡萄球菌MIC是50 mg/l，低于本試驗中抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MIC值，說明金黃色葡萄球菌對抗菌肽S-Thanatin的敏感性要強于實驗選用的抗菌肽。在周義文等[12]的研究中，家蠅抗菌肽對耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）有一定的抗菌活性，其MIC值為20 μg/ml，又有裴穎等[13]研究表明，泥鰍抗菌肽對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為12.25 μg/μl，說明不同抗菌肽對不同細菌有不同程度的抑制作用，即使對同一種細菌，由于其抗菌肽來源不同，也會產(chǎn)生不同抑菌效果。管淑玉等[14]的研究顯示，苦楝葉和羊蹄甲葉石油醚萃取部分（按生藥計）對副溶血弧菌的最小抑菌濃度（MIC）均為50 mg/ml，大于本研究中抗菌肽對副溶血弧菌的MIC（0.8 mg/ml），說明抗菌肽抑菌效果要強于苦楝葉和羊蹄甲葉石油醚萃取物；但在陳琛等[15]的研究結(jié)果中，五倍子、訶子提取物對副溶血弧菌的MIC分別為0.06、0.036 mg/ml，低于0.8 mg/ml；黃岑、大黃、烏梅、艾葉、連翹、黃連、牡丹皮、金銀花等中草藥提取物對副溶血弧菌的MIC分別為0.98、0.98、3.91、3.91、1.95、3.91、1.95、1.95 mg/ml，均高于0.8 mg/ml，表明在對副溶血弧菌敏感性方面，抗菌肽對副溶血弧菌的敏感程度要弱于五倍子、訶子提取液，要強于黃岑等8種中草藥提取液。也有研究顯示[16]，五味子和黃精水煎液對副溶血弧菌的MIC均為1.56 mg/ml，而本試驗中抗菌肽對副溶血弧菌的MIC為0.8 mg/ml，表明在抑菌性方面，抗菌肽的抑菌效果還是要強于五味子和黃精。在相關的研究中發(fā)現(xiàn)[17-19]，石榴皮、地榆、五味子、大黃、五倍子、公丁香、黃連、黃精等中草藥提取液均對溶藻弧菌有一定的抑菌效果，最小抑菌濃度均高于抗菌肽對溶藻弧菌的MIC值（1.6 mg/ml），表明在抗菌效果方面，抗菌肽優(yōu)于大多數(shù)的中草藥。本試驗選用的抗菌肽對嗜水氣單胞菌的MIC是3.2 mg/ml，相比較羅新等[20]研究五倍子（MIC為7.813 mg/ml）、訶子（MIC為15.625 mg/ml）、黃連（MIC為62.5 mg/ml）、石榴皮（MIC為250 mg/ml）、艾葉（MIC為250 mg/ml）、烏梅（MIC為1 000 mg/ml）等中性中草藥藥液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果更好，相比較裴穎等[13]研究泥鰍抗菌肽對嗜水氣單胞菌的抑菌活性（MIC為0.195 μg/μl）要弱。為了更有針對性、更有效地利用抗菌肽在微生物飼料添加劑的廣泛應用和推廣，還須進一步探明其抑菌機理和對其他不同類型菌種的深入研究。

表2 抗菌肽對指示菌的最低抑菌質(zhì)量濃度

圖1 牛津杯法測定不同質(zhì)量濃度抗菌肽的抑菌圈直徑

3 結(jié)論

本試驗采用牛津杯法獲得的抑菌圈質(zhì)量較高，重復性較好，得到這種抗菌肽對金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）分別為0.8、1.6、0.8、3.2 mg/ml，對這四種指示菌的抑菌作用能力由高至低分別是金黃色葡萄球菌＞副溶血弧菌＞溶藻弧菌＞嗜水氣單胞菌。