■任玉琴 吳望君 張曉麗

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州311199）

我國是維生素K3的生產(chǎn)大國，其生產(chǎn)總量已超過全球產(chǎn)量的一半。維生素K3具有凝血功能，在畜禽和水產(chǎn)飼料中被廣泛使用，中國獸藥典[1]、中國藥典[2]均收載了亞硫酸氫鈉甲萘醌，農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄(2013)》[3]收錄了3種維生素K3類飼料添加劑，即亞硫酸氫鈉甲萘醌(MSB)、亞硫酸氫煙酰胺甲萘醌(MNB)和二甲基嘧啶醇亞硫酸甲萘醌(MPB)。MSB、MNB和MPB均以甲萘醌為官能團(tuán)，在側(cè)鏈上與不同基團(tuán)結(jié)合形成的衍生物。維生素K3在飼料中的留存率低，飼料加工、載體等影響產(chǎn)品在飼料中的穩(wěn)定性，在畜禽飼喂中生物利用率也存在差異，其中MNB在飼料中最具穩(wěn)定性，生物利用率最高，MPB次之，MSB最不穩(wěn)定[4]。MSB、MNP和MPB具有類似的功能和外觀，現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法中采用甲萘醌官能團(tuán)和相應(yīng)的衍生基團(tuán)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，如甲萘醌的沉淀反應(yīng)、二氧化硫的氣味鑒別及煙酰胺的薄層色譜法等，鑒別方法繁鎖，專屬性不強(qiáng)[5]，需用多種方法加以配套。本文建立了用高效液相色譜法同時(shí)鑒別3類維生素K3化合物，方法操作簡便、專屬性強(qiáng)，能有效甄別3類維生素K3。

1 材料和試劑

亞硫酸氫鈉甲萘醌，批號(hào)：11203112、11203203、12070701；亞硫酸氫煙酰胺甲萘醌，批號(hào)：13052902、13081204、13081302；二甲基嘧啶醇亞硫酸甲萘醌，批號(hào)：10122701、11052905、11052806；均來源于兄弟科技有限公司。

甲萘醌對照品：由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，批號(hào)V0011003，含量為99.3%。

2 儀器和設(shè)備

Angliln1100高效液相色譜儀，帶DAD檢測器；Waters 2690高效液相色譜儀，帶UV檢測器；北京普析通用公司，TU-1910紫外-可見分光光度計(jì)。

3 高效液相色譜法方法的建立

3.1 檢測波長的篩選

取上述三種產(chǎn)品適量，加水溶解，按照紫外分光光度法，在200～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果三種產(chǎn)品在230 nm處均有最大吸收，在265 nm處有次吸收（見圖1），擬用230 nm作為檢測波長。

3.2 色譜條件的建立

GB/T 26442—2010[6]亞硫酸氫煙酰胺甲萘醌標(biāo)準(zhǔn)中用液相色譜方法測定含量，按該方法對 MSB、MPB和MNB進(jìn)行測定，結(jié)果MPB和MNB均出現(xiàn)2個(gè)保留時(shí)間相同的主峰，見圖2～圖3，其中1個(gè)主峰保留時(shí)間同MSB主峰，該方法無法區(qū)分MNB和MPB。煙酰胺、二甲基嘧啶醇以共價(jià)鍵的形式與亞硫酸氫甲萘醌結(jié)合，極性較強(qiáng)的基團(tuán)在普通的ODS C18柱上較難保留與分離，因此選用Waters Atlantis?HILIC Silica色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈/水（80∶20）為流動(dòng)相，230 nm為檢測波長，流速1 ml/min，進(jìn)樣量20 μl。

圖1 MSB、MPB、MNB紫外吸收光譜圖

圖2 MPB色譜圖

圖3 MNB色譜圖

3.3 測定

取樣品適量，用水分別溶解稀釋成0.04 mg/ml的上機(jī)溶液，用高效液相色譜儀上機(jī)測定，結(jié)果MNB和MPB溶液在色譜中均分離成兩種組分，分別為與MSB主峰保留時(shí)間一致的亞硫酸氫甲萘醌色譜峰和二甲基嘧啶醇、煙酰胺組分色譜峰，MSB、MPB、MNB在該色譜條件下得到較好的分離，亞硫酸氫甲萘醌、煙酰胺和二甲基嘧啶醇色譜峰的分離度R≥1.9。見圖4～圖7。

3.4 色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積比的考察

由于MPB、MNB在色譜中均有2個(gè)主峰，鑒于目前國內(nèi)還沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供，為此用相對保留時(shí)間和相對峰面積比對MPB、MNB產(chǎn)品進(jìn)一步考察，并用不同儀器、不同時(shí)間和小幅改變流動(dòng)相比例，考察方法的耐用性。

圖4 MSB液相色譜圖

圖5 MNB液相色譜

圖6 MPB液相色譜圖

圖7 MSB、MPB、MNB重疊色譜圖

色譜條件：流動(dòng)相：乙腈/水（90∶10），色譜柱：Waters Atlantis?HILIC Silica（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速：1 ml/min，檢測波長：230 nm。

取試樣適量，用水溶解稀釋成濃度約為0.04 mg/ml溶液，用不同品牌的2臺(tái)儀器上機(jī)測定。結(jié)果見表1。

表1 MSN、MPB、MNB檢測結(jié)果

上述測定結(jié)果顯示，用不同儀器和時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩個(gè)主成分峰相對保留時(shí)間MPB均為0.19，MNB為 0.30～0.32；峰面積比值 MPB 分別為 2.49～2.70、2.99～3.04；MNB為2.98～3.03、2.79～3.21，在該色譜條件下，組分的相對保留時(shí)間有較好的重現(xiàn)性，但組分峰面積比值范圍有交叉。

4 討論和結(jié)論

亞硫酸氫鈉甲萘醌(MSB)、亞硫酸氫煙酰胺甲萘醌(MNB)和二甲基嘧啶醇亞硫酸甲萘醌（MPB）均未在USP[7]、BP[8]和EP[9]標(biāo)準(zhǔn)收載。MSB和MNB分別以 GB/T 7294—2009[10]、GB/T 26442—2010國家標(biāo)準(zhǔn)頒布。在含量測定中，MSB以甲萘醌為測定目標(biāo)，通過分子量換算計(jì)算MSB含量；MNB用液相色譜外標(biāo)法測定煙酰胺和亞硫酸甲萘醌含量，方法準(zhǔn)確性好，但該色譜條件無專屬性，MPB和MNB均呈現(xiàn)保留時(shí)間相同的2個(gè)色譜峰，因此產(chǎn)品的鑒別尤為重要。MSB的鑒別試驗(yàn)包括以甲萘醌官能團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)與熔點(diǎn)鑒別及用二氧化硫氣體鑒別亞硫酸根；MNB的鑒別試驗(yàn)也包括甲萘醌官能團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)鑒別、熔點(diǎn)鑒別及用薄層色譜法鑒別煙酰胺，需用相應(yīng)的配套試驗(yàn)完成產(chǎn)品鑒別，產(chǎn)品間鑒別有交叉，專屬性不夠。本文研究建立的鑒別方法，有效解決了上述問題，該色譜方法，用保留時(shí)間或相對保留時(shí)間就能有效鑒別3種維生素K3類化合物，方法簡單，重現(xiàn)性好。