■田苗苗 毛思宇 王 偉

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000）

蛋白質(zhì)經(jīng)降解后，抗氧化活性較強(qiáng)的疏水性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來(lái)，得到的多肽和小肽的抗氧化能力要優(yōu)于蛋白質(zhì)和氨基酸。一般抗氧化活性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物由3～6個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量小于600～2 000[1]。與普通大豆相比，黑豆蛋白的蛋白質(zhì)和疏水性氨基酸含量均有明顯的提高，更有利于開(kāi)發(fā)成具有生物活性肽類(lèi)產(chǎn)品[2]。微生物發(fā)酵可產(chǎn)生復(fù)合酶系，能夠有效降解蛋白質(zhì)，且反應(yīng)溫和，通過(guò)微生物調(diào)節(jié)酶系，生產(chǎn)效率更高。微生物發(fā)酵中各種發(fā)酵條件影響最終的發(fā)酵效果。響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM）是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析，改變了正交試驗(yàn)只能單純對(duì)孤立試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析的不足，更有助于發(fā)酵條件的優(yōu)化，且所得圖形直觀，因此被廣泛應(yīng)用于眾多領(lǐng)域的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與工藝優(yōu)化研究中[3-5]。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室在前期工作中得到了一株高產(chǎn)蛋白酶菌株B-5（Bacillus sp.）并對(duì)其產(chǎn)酶性能進(jìn)行了研究。本研究以肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，擬采用單因素試驗(yàn)，分別對(duì)碳源種類(lèi)、碳源含量、氮源含量、裝瓶量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間及接種量等因素進(jìn)行考察，以確定其對(duì)于B-5液體發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響，最終確定影響最顯著的3個(gè)因素，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立肽轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值的回歸方程模型，利用Design-Expert得到最優(yōu)液體發(fā)酵條件，為放大試驗(yàn)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌菌株B-5：由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基

NA、NB培養(yǎng)基的配制方法具體參見(jiàn)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[6]。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：黑豆蛋白10%，0.84%Na2HPO4，0.032%KH2PO4，0.17%CaCl2，混勻后調(diào) pH值6.0～6.5，115 ℃滅菌30 min。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種擴(kuò)培及種子培養(yǎng)

配制NA培養(yǎng)基，分裝于試管后121℃濕熱滅菌20 min，趁熱擺斜面。在無(wú)菌環(huán)境下，將實(shí)驗(yàn)室已有菌株B-5菌株接種于NA培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的B-5菌株接種于NB培養(yǎng)基中，裝液量為75 ml/250 ml三角瓶，180 r/min搖床培養(yǎng)14 h，得到種子液。

2.2 發(fā)酵條件的影響試驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。在優(yōu)化培養(yǎng)基組成時(shí)均采用以下培養(yǎng)條件：將種子液以2%的接種量，接入75 ml/250 ml三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，收集上清液進(jìn)行冷凍干燥，分別進(jìn)行肽轉(zhuǎn)化率的測(cè)定。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同碳源的影響

分別以濃度為2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等供試碳源配制7種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，均加入10%黑豆蛋白、0.8%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、0.2%CaCl2，混勻后調(diào) pH 值6.5，發(fā)酵后以肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)考察菌株B-5對(duì)不同碳源的利用情況。比較，篩選出最適的碳源。

2.3.2 單因素試驗(yàn)

分別以碳源含量、氮源含量、裝瓶量、接種量、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間作為考察因素，以肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)考察各因素的合適范圍。

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取其中3個(gè)主要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)(見(jiàn)表1)。以肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0.6中關(guān)于響應(yīng)面的部分，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行設(shè)計(jì)、分析和優(yōu)化。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.4 肽轉(zhuǎn)化率和DPPH清除率的測(cè)定方法

2.4.1 總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定。

2.4.2 酸溶蛋白質(zhì)的測(cè)定

將發(fā)酵液經(jīng)三氯乙酸處理后，采用凱氏定氮法測(cè)定酸溶蛋白質(zhì)含量。

2.4.3 游離氨基酸含量的測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定。

2.4.4 肽轉(zhuǎn)化率

肽含量為上清液中的酸溶蛋白質(zhì)含量減去游離氨基酸含量。

式中：m1——酸溶蛋白質(zhì)含量（g）；

m2——游離氨基酸含量（以粗蛋白質(zhì)計(jì)，g）；

m——原黑豆蛋白質(zhì)含量（g）。

2.4.5 DPPH清除率的測(cè)定方法[7]

分別取優(yōu)化前后的樣品各0.5 g，加入蒸餾水稀釋至濃度為5 mg/μl的樣品溶液。分別取樣品溶液1.0 ml和0.4 mmol/l的DPPH溶液0.5 ml依次加入到試管中，震蕩均勻，放于37℃水浴中保溫，避光反應(yīng)30 min。將反應(yīng)后的溶液用分光光度計(jì)在517 nm測(cè)得A，同時(shí)以無(wú)水乙醇做空白對(duì)照，測(cè)得A0，采用下列公式計(jì)算DPPH清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響(見(jiàn)圖1)

B-5菌株可以利用多種碳源發(fā)酵后降解大分子蛋白為多肽，從圖1可以看出B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的最適碳源為蔗糖。

圖1 不同碳源的影響

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 碳源含量(蔗糖濃度)對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響(見(jiàn)圖2)

圖2 不同碳源含量的影響

從圖2可以看出，不同的蔗糖含量對(duì)于B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽有明顯的影響，肽轉(zhuǎn)化率隨著蔗糖含量的增加而增加，蔗糖含量為3%之后緩慢降低，因此最終選擇碳源最佳含量為3%。

2.2.2 氮源含量（黑白蛋白濃度）對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響(見(jiàn)圖3)

從圖3可以看出，不同的氮源含量對(duì)于B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽有明顯的影響，氮源含量為2%～11%時(shí)，肽轉(zhuǎn)化率隨著氮源含量的增加而增加，之后緩慢降低，因此氮源的最佳含量為11%。

圖3 不同氮源含量的影響

2.2.3 裝瓶量對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響(見(jiàn)圖4)

圖4 不同裝瓶量的影響

從圖4可以看出，裝瓶量對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽量的影響不明顯。裝瓶量為75 ml/250 ml時(shí)，肽轉(zhuǎn)化率較高，因此選其為最適裝瓶量。

2.2.4 接種量對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響(見(jiàn)圖5)

圖5 不同接種量的影響

從圖5可以看出，接種量對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽量的影響較明顯。接種量為4%～6%時(shí)，肽轉(zhuǎn)化率增加明顯，之后有所下降，因此接種量為6%時(shí)，肽轉(zhuǎn)化率最高。

2.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響(見(jiàn)圖6)

圖6 不同培養(yǎng)溫度的影響

從圖6可以看出，35℃以后，肽轉(zhuǎn)化率較平穩(wěn)，因此選擇最佳發(fā)酵溫度為35℃。

2.2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響（見(jiàn)圖7）

隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，B-5菌株產(chǎn)生蛋白酶等酶類(lèi)，可以將大分子蛋白有效進(jìn)行降解，從圖7可以看出，72 h之后，肽轉(zhuǎn)化率變化不大，因此選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 B-5菌株產(chǎn)多肽響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果，確定蔗糖含量、氮源濃度和接種量為影響B(tài)-5菌株發(fā)酵降解蛋白質(zhì)為多肽的3個(gè)主要影響因素。以肽轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 以肽轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值的B-5菌株產(chǎn)多肽響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6軟件，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合。以肽轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值（Y），蔗糖含量（A）、氮源濃度（B）、接種量（C）為自變量，建立回歸方程如下：

對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。液體發(fā)酵產(chǎn)多肽響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@著水平＜0.000 1，失擬項(xiàng)0.062 9＞0.05，說(shuō)明此回歸模型較為理想。模型中A、B、C的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均顯著（P＜0.01或P＜0.05），表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小，可以用該方程對(duì)不同發(fā)酵條件下的Y值進(jìn)行預(yù)測(cè)。二次響應(yīng)面回歸模型的決定系數(shù)R2值為0.985 8（軟件自動(dòng)計(jì)算得出）。說(shuō)明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性，可以用于該菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的理論預(yù)測(cè)。

2.3.2 B-5菌株產(chǎn)多肽響應(yīng)面分析

利用Design-Expert 8.0.6對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸，擬合得到二次回歸方程的響應(yīng)曲面及其等高線(見(jiàn)圖8～圖10)。每個(gè)響應(yīng)面分別代表2個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，第3個(gè)變量保持在0水平。

表3 B-5菌株產(chǎn)多肽響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析

圖8 蔗糖含量和黑豆蛋白含量對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響

從圖8可以看出，蔗糖含量與黑豆蛋白含量的影響極顯著(P＜0.01)，響應(yīng)值變化幅度較大，曲線較陡，沿蔗糖含量方向的等高線密度大于沿黑豆蛋白含量方向的等高線密度，說(shuō)明兩者中蔗糖含量對(duì)肽轉(zhuǎn)化率的影響更明顯。從圖9可以看出，蔗糖含量與接種量的影響顯著(P＜0.05)，響應(yīng)值變化幅度較大，曲線較陡，沿蔗糖含量方向的等高線密度大于沿接種量方向的等高線密度，說(shuō)明二者中蔗糖含量對(duì)肽轉(zhuǎn)化率的影響更明顯。從圖10可以看出，黑豆蛋白含量與接種量含量的影響極顯著(P＜0.01)，響應(yīng)值變化幅度較大，曲線較陡，沿黑豆蛋白含量方向的等高線密度大于沿接種量方等高線的密度，說(shuō)明二者中黑豆蛋白含量對(duì)肽轉(zhuǎn)化率的影響更明顯。

2.3.3 B-5菌株產(chǎn)多肽響應(yīng)面結(jié)果的優(yōu)化分析和條件驗(yàn)證

圖9 蔗糖含量和接種量對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響

圖10 黑豆蛋白含量和接種量對(duì)B-5菌株發(fā)酵產(chǎn)多肽的影響

綜上所述，回歸方程對(duì)B-5菌株產(chǎn)多肽響應(yīng)面試驗(yàn)擬合良好，可用此回歸方程對(duì)B-5菌株產(chǎn)多肽響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析。采用Design-Expert8.0.6軟件獲取肽轉(zhuǎn)化率的極大值，結(jié)果為蔗糖含量2.06%，黑豆蛋白含量11.35%，接種量7.19%，肽轉(zhuǎn)化率為68.035%。考慮試驗(yàn)的實(shí)際情況，確定蔗糖含量2.1%，黑豆蛋白含量11.4%，接種量7.2%，此時(shí)肽轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)值達(dá)到68.029%。在該條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定該菌株發(fā)酵的肽轉(zhuǎn)化率為（67.921±0.81）%。采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌株發(fā)酵得到肽轉(zhuǎn)化率為（39.35±0.31）%，故優(yōu)化后肽轉(zhuǎn)化率提高了72.61%。

2.4 體外抗氧化活性的測(cè)定

以DPPH消除率為指標(biāo)，分別對(duì)優(yōu)化前后得到的發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性能進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化前的樣品1的清除率為52.31%，優(yōu)化后樣品2的清除率為79.12%，與優(yōu)化前相比，提高了51.25%。

3 討論與結(jié)論

黑豆質(zhì)硬、難于消化，且口感不佳，除少量藥用或加工成豆豉等食品外，開(kāi)發(fā)程度一直較低。黑豆蛋白含量高，營(yíng)養(yǎng)好，是一類(lèi)重要的植物蛋白資源[8]，經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生黑豆肽可以提高蛋白質(zhì)利用率并使得產(chǎn)物具有抗氧化性能、降低膽固醇、緩解疲勞、輔助降血脂等特殊活性[9]。本研究采用單因素法和響應(yīng)面法對(duì)B-5菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用DPPH法對(duì)優(yōu)化后發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性能進(jìn)行了測(cè)定，確定當(dāng)蔗糖含量2.1%，黑豆蛋白含量11.4%，接種量7.2%，測(cè)定該菌株發(fā)酵的肽轉(zhuǎn)化率為（67.921±0.81）%，與優(yōu)化前相比提高了72.61%，且優(yōu)化后發(fā)酵產(chǎn)物的清除率為79.12%，與優(yōu)化前相比，提高了51.25%，為進(jìn)一步分離抗氧化肽并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定建立了基礎(chǔ)。