豬繁殖與呼吸綜合征病毒LJ株分離鑒定與免疫原性試驗

張芷寧

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬藍耳病病毒引起的一種以厭食、高熱，懷孕母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎，并且各年齡段豬呼吸障礙為特征的高度接觸性傳染病。此病最早于1987年在美國發(fā)現(xiàn)。1991年，Wensvoot等首次從母豬體內(nèi)及發(fā)病仔豬分離到該病毒，當時命名為Lelystad病毒。隨后在英國、美國、德國等地區(qū)也分離到了此病毒。目前，該病已在全世界范圍內(nèi)傳播，并且遍及歐洲及北美洲。在我國，郭寶清等在1996年首次從疑似藍耳病患豬群中分離到藍耳病毒，證實了藍耳病在我國的流行。該病傳播迅速，在經(jīng)濟發(fā)達國家，隨著豬群密集增加、流動頻繁，更容易導(dǎo)致此病的流行。

本研究采集某豬場具有高熱癥狀病豬的病料，并從此病料中分離到一株病毒，將該病毒接種到Marc-145細胞上，發(fā)現(xiàn)此病毒可以在Marc-145細胞上增殖，并且產(chǎn)生以圓縮、聚集、脫落為特征細胞病變。經(jīng)RT-PCR鑒定以及間接免疫熒光試驗，結(jié)果證實該病毒為美洲型PRRSV，將其命名為PRRSV LJ株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本及試驗用用細胞

采集發(fā)病豬場高熱死亡仔豬的肺臟及淋巴結(jié)，置于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩arc-145細胞由本研發(fā)中心保存。

1.1.2實驗動物

選取3-4周齡PRRSV抗體陰性健康仔豬25頭，并且經(jīng)檢測無偽狂犬病野毒抗體，購自哈爾濱市阿城某養(yǎng)殖場。

1.1.3實驗試劑

胎牛血清購自山東勁牛，MEM細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1病毒分離與鑒定

1.2.1.1病料的處理

將病料剪成一定體積的大小，加入含5%血清的MEM，研磨成勻漿，然后12，000rpm 4℃離心10min，用0.22岬濾器對上清進行過濾除菌。

1.2.1.2 RNA提取

1）準備一離心管，移取5μLpoly（A）到管底，移取200μLRLS液到管內(nèi)，然后在離心管內(nèi)分別移入200μL樣品，再加入25μLproteinase K。蓋上蓋子，徹底混勻后，55℃消化10-20分鐘。

2）加入200μL無水乙醇，顛倒離心管以混勻。

3）全部加入吸附柱中，9，000g離心1 min。倒掉收集管中液體，將吸附柱放回收集管中。

4）加入500μLRP液，靜止1min，離心1 min，倒掉收集管內(nèi)液體，將吸附柱放回收集管中。

5）加入600μLW3液，離心1min，倒掉收集管中液體，將吸附柱放回收集管中。

6）加入250μLW3液，靜止1 min后，離心2min。

7）將吸附柱移入一個干凈的1.5mL離心管內(nèi)，在吸附膜中央加入25-50μL水靜置1 min，離心2min，輕微混勻后，貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3引物的設(shè)計

參考（童光志，2007年）合成2對引物，使用該引物進行RT-PCR對病料或細胞培養(yǎng)物進行病毒核酸的檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成（見表1）。

1.2.1.4 RT-PCR

RNA的反轉(zhuǎn)錄程序：

反轉(zhuǎn)錄體系為25μL，RNA模板11.0μL，引物（50pmol/μL）2.0μL，70℃水浴5min，冰浴5min，再加入5xM-MLV RTBuffer 5.0μL，dNTP（2.5mmol/L）5.0μL，RNAase抑帶劑1.0μL，鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）1.0μL，42℃水浴90min，70℃水浴15min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

反應(yīng)體系25μL：10xPCRBuffe r 2.5μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5μL，上下游引物（10pmol/μL）各1μL，模板1.0μL，5U/μL rTaq 0.5μL，滅菌去離子水補足。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃終延伸7min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.1.5 PRRSV的分離與培養(yǎng)

RT-PCR檢測為陽性的病料上清過濾除菌后，接種于已長至90%的單層Marc-145細胞上，每個T-25細胞瓶1mL，放入37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h，棄上清并加入含2%胎牛血清的DMEM9mL繼續(xù)37℃培養(yǎng)。每日觀察細胞病變情況，當細胞出現(xiàn)80%以上的細胞病變（CPE）時，收毒，凍融3次后繼續(xù)盲傳至第三代。每個代次抽取小樣，96孔細胞板測定TCIDso。

1.2.1.6免疫熒光技術(shù)鑒定

對出現(xiàn)病變的細胞培養(yǎng)物進行10倍稀釋，然后接種到長滿單層Marc-145細胞的96孔板內(nèi)，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)2-4d，并設(shè)立陰性細胞對照，培養(yǎng)結(jié)束后，將細胞培養(yǎng)物用預(yù)冷的丙酮固定10min，然后使用PBS進行沖洗，沖洗3次，放置室溫使其自然晾干，然后保存于4℃?zhèn)溆?。將固定好?6孔培養(yǎng)板取出，每孔加入50μL20倍稀釋的PRRSV陽性血清，置于濕盒中，使其在37℃作用45 min，然后清洗3次，5min/次，之后每孔加入100倍稀釋的FITC-兔抗豬IgG，置于濕盒中，使其在37℃作用45 min，然后清洗3次，5 min/次，清洗后置于室溫自然晾干，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.1.7序列分析

把PRRSV陽性的病料及分離毒株的Nsp2片段和ORF5全基因序列進行擴增測序，然后與GenBank中的PRRSV序列進行比較并制作基因序列進化樹。

1.3 PRRSV LJ株免疫原性試驗

1.3.1試驗分組及試驗方案

選取3～4周齡PRRSV抗體陰性仔豬25頭，隨機分成5組，5頭/組，A、B、C、D組分別免疫2mL病毒含量為107.0TCIDso、106.OTCID50、105.0TCIDso和104.0TCIDso的滅活苗免疫，E組為空白對照組，免疫經(jīng)過乳化的DMEM培養(yǎng)基2mL，所以免疫均采用頸部肌肉注射。于免疫后1、2、

3、4周分別采血，用ELISA方法測定藍耳抗體水平。

1.3.2攻毒方案

在免疫28d后，各組豬只頸部肌肉注射3mL PRRSV LJ株強毒（105TClD50/mL），攻毒后第二天開始逐日測體溫，并觀察記錄臨床表現(xiàn)，所有豬只在攻毒前及攻毒后3周進行稱重，在攻毒后的1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d進行采血檢測PRRSV。28d時所有豬只進行撲殺，采集心臟、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、肺臟及腎臟，檢測組織中的PRRSV。

2結(jié)果

2.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離

將處理好的病料按3%接種于長滿單層的Marc-145細胞，置于37℃進行培養(yǎng)，接種后3～4d，在顯微鏡下可觀察到以圓縮、聚集、脫落為特征細胞病變（圖1）。

對Marc-145細胞第3代病毒培養(yǎng)液進行RT-PCR擴增，得到2條大小分別為640 bD和796bp擴增條帶，經(jīng)對比得知，此條帶大小與目的片段大小一致（見圖2）。

2.2 PRRSV分離株的IFA鑒定

對Marc-145細胞第3代病毒培養(yǎng)液進行間接免疫熒光檢測，可以觀察到接種病毒的細胞出現(xiàn)特異性綠色熒光，未接種病毒的細胞未見熒光（見圖3）。

2.3序列分析

通過進化樹分析得知分離病毒LJ株與2006年分離的高致病性藍耳病毒株的序列遺傳關(guān)系較近。

2.4免疫原性結(jié)果

2.4.1免疫不同病毒含量滅活疫苗后的抗體檢測

將所有實驗豬按照上述方法采血，進行抗體檢測，OD值>0.42可判為陽性，OD值<0.38可判為陰性，0.38

2.4.2攻毒后臨床和體溫觀察

攻毒后3d開始，A、B、C組體溫正常。而D組與E組則出現(xiàn)體溫明顯升高，體溫都在40.5℃以上，并且體溫升高持續(xù)時間較長（圖4）。

攻毒后D組與E組仔豬出現(xiàn)呼吸困難，咳喘，耳尖發(fā)紺，體溫升高，而A、B、C組未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。

2.4.3攻毒后病毒血癥情況

采集仔豬攻毒前、攻毒后1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d、28d的血液，提取病毒核酸，檢測血液中的PRRSV。結(jié)果見表3，從結(jié)果可以看出A組僅有1頭豬在攻毒后第2d的血液中檢測到PRRSV，但在14d后，血液中檢測不到PRRSV；而其它組的豬幾乎全部能檢測到PRRSV，并且部分豬的病毒血癥一直持續(xù)到28d，由此可見免疫該疫苗能減少豬的病毒血癥，并且在一定程度上縮短病毒血癥的時間，抵抗病毒的增值。

2.4.4不同組織中PRRSV檢測結(jié)果

攻毒后28d時所有豬只進行撲殺，采集心臟、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、肺臟及腎臟，檢測組織中的PRRSV結(jié)果（表4），顯示：D組和E組所有豬的組織中都有PRRSV存在，C組和B組各2頭豬從淋巴結(jié)和脾臟檢測到PRRSV，但在腦組織和腎臟組織中未檢測到PRRSV，表明A、B、C組疫苗免疫后能有效降低豬體的帶毒。

4結(jié)論

本研究利用本實驗室從臨床發(fā)病豬組織分離鑒定的滴度較高的PRRSV LJ株。在本動物豬上進行了該毒株的免疫原性試驗，結(jié)果表明，使用該疫苗能提供堅實的保護，為我國藍耳病的防控提供有效的措施和方案。