繆成貴 周麗麗 熊友誼 魏 偉 陳兵兵 常 俊

(安徽科技學院生命與健康科學學院，鳳陽 233100)

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、持續(xù)性的自身免疫性疾病，發(fā)病特征集中在手、足小關(guān)節(jié)等處，呈對稱性、侵襲性關(guān)節(jié)滑膜炎癥，并發(fā)展為軟骨侵蝕、骨的不可逆性損壞[1]。RA伴有關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風濕因子陽性，嚴重者導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失[2]。RA發(fā)病機制目前仍不清楚，研究表明關(guān)節(jié)滑膜中成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)的異常增殖在RA發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[3]。完全弗氏佐劑制備的佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠病理特點與人RA非常相似，是常用的RA病理機制研究和藥物治療研究的動物模型[4]。芍藥苷(Paeoniflorin,PF)來源于中藥材毛莨科植物芍藥根、牡丹根、紫牡丹根，作為中藥材芍藥中的主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、擴張血管、抗炎抗?jié)?、解熱解痙等藥理作用[5]。本文以AA大鼠作為RA研究的動物模型，以FLS異常增殖作為研究切入點，從分子水平深入研究PF影響AA大鼠病理的機制，為RA防治提供新思路新方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設(shè)備 倒置熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司；實時定量PCR儀：美國ABI公司；超純水系統(tǒng)：美國密理博Milli-Q Reference；酶標儀：美國BioTek公司；臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；-80℃超低溫冰柜：日本三洋公司；細胞培養(yǎng)箱：美國熱電公司；超凈工作臺：上海智城ZHJH-C1214C；紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器公司；電子天平BP211D：德國Sartarius。

1.1.2藥品試劑 PF：上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，規(guī)格20 mg/支，CAS 23180-57-6；QuantiFast?SYBR?Green PCR試劑盒：德國Qiagen公司產(chǎn)品；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒：美國Fermentas公司產(chǎn)品；Opti-MEM：美國Invitrogen公司；新生胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)：美國Hyclone公司產(chǎn)品；ELISA：上海源葉生物科技有限公司；MTT、焦碳酸二乙酯(DEPC)：美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2實驗方法

1.2.1AA大鼠制備及大鼠足爪腫脹評分 SD雄性大鼠，體重180～200 g，安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供(合格證號：皖醫(yī)動準01號)。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除正常組外，其余各組采用大鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.1 ml完全弗氏佐劑致炎的方法制備AA大鼠。對于PF灌胃給藥，購入的實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機分為6組：正常組、AA組、PF 5 mg/kg、PF 10 mg/kg、PF 20 mg/kg組、PBS組(空白對照)，每組10只。對于PF細胞給藥，分為6組：正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml組、PBS組(空白對照)。大鼠足爪腫脹評分對象包括五只指關(guān)節(jié)或趾關(guān)節(jié)，一只腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)，共24個評分對象，每個評分對象出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫計1分，無結(jié)節(jié)和紅腫計0分，每只大鼠的足爪腫脹評分最大值是24。

1.2.2FLS原代培養(yǎng) AA大鼠制備后第28天股動脈放血處死大鼠，無菌條件下取滑膜組織，去除脂肪、纖維等，取出大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜，無Ca2+、Mg2+D-Hanks液漂洗3次后剪成約1～2 mm3小塊。用無菌玻璃吸管轉(zhuǎn)移滑膜組織小塊均勻排列在培養(yǎng)瓶中的底壁上，加2 ml含胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 h，使其貼壁。取出培養(yǎng)瓶，加入預(yù)溫的含胎牛血清的DMEM 1 ml培養(yǎng)基，再置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。3 d后更換培養(yǎng)基，待滑膜FLS長出組織塊較多后，棄除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶瓶底達90%時，加胰蛋白酶0.5 ml消化細胞進行傳代培養(yǎng)，實驗用細胞為傳代3～5次的FLS。

1.2.3MTT檢測PF對AA大鼠FLS增殖的影響 取對數(shù)生長期FLS，胰酶消化制備1×105ml-1細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl，鋪板后細胞密度1 000～10 000個/孔。細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2培養(yǎng)6～8 h后，向FLS中加入PF 100、200、400 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h?？瞻讓φ障騀LS培養(yǎng)液中加入等量PBS。每孔加入20 μl MTT液(5 mg/ml，即0.5%MTT溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，加樣器吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床低速振蕩10 min，酶標儀490 nm檢測吸光度。

1.2.4Real time qPCR檢測Bax、Caspase 3、Bcl-2、Fibronectin表達 分離培養(yǎng)各組大鼠FLS，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)5%CO2，37℃培養(yǎng)至3代后，加藥PF 100、200、400 μg/ml 進入FLS培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h?？瞻讓φ障騀LS培養(yǎng)液加入等量PBS。采用Trizol法(Qiagen)常規(guī)提取細胞總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)提供的方法逆轉(zhuǎn)錄得到各組細胞的cDNA，參照Qiagen公司試劑盒提供的Real time qPCR檢測方法檢測加藥各組FLS中Bax、Caspase 3、Bcl-2、Fibronectin基因表達。mTOR基因擴增反應(yīng)條件為：94℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s。共40個循環(huán)。定量PCR引物序列見表1。

表1RealtimeqPCR引物序列

Tab.1SequenceofrealtimeqPCRprimer

PrimerSense(5′ to 3′)Anti-sense(5′ to 3′)BaxTTGCTACAGGGTTTCATCCATGTTGTTGTCCAGTTCATCGCaspase 3ACGGGACTTGGAAAGCATCTAAGGAAGCCTGGAGCACAGBcl-2GGTGGACAACATCGCTCTGCAGCCAGGAGAAATCAAACAFibronectinGACACTATGCGGGTCACTTGCCCAGGCAGGAGATTTGTTAβ-actinCCCATCTATGAGGGTTACGC TTTAATGTCACGCACGATTTC

1.2.5ELISA檢測IL-8表達 分離培養(yǎng)各組大鼠FLS，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)FLS至3代后，加藥PF 100、200、400 μg/ml進入FLS培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，空白對照向FLS培養(yǎng)液加入等量PBS。采用上海源葉生物科技有限公司提供的ELISA檢測試劑盒檢測IL-8表達，根據(jù)試劑盒提供的檢測步驟設(shè)置標準品孔和樣品孔。標準品孔加入不同濃度試劑盒提供的標準品50 μl，樣品孔加待測樣品10 μl，再加樣品稀釋液40 μl，空白孔作為對照不加試劑。標準品孔和樣品孔中每孔再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體100 μl，37℃條件下封閉孵育60 min。然后棄凈孔中試劑，每孔加滿洗滌液靜置1 min，再棄凈洗滌液，重復(fù)此操作5次。然后每孔中加檢測底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min，每孔最后加終止液50 μl，15 min內(nèi)采用 450 nm波長測定各孔的OD值。

2 結(jié)果

2.2PF抑制AA大鼠FLS Fibronectin基因表達 PF加藥后48 h，采用Real time qPCR檢測Fibronectin在正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml組、PBS組大鼠FLS中的表達。結(jié)果顯示，與正常組相比，F(xiàn)ibronectin在AA組大鼠FLS中相對表達量由1升高至3.285 5，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與AA組相比，F(xiàn)ibronectin在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三組中表達顯著降低，分別由3.285 5降低至2.365 8、2.307 7、2.297 6，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.3PF抑制AA大鼠FLS IL-8表達 PF加藥后48 h，ELISA檢測IL-8在正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml組、PBS組大鼠FLS中的表達。結(jié)果顯示，與正常組相比，AA組IL-8的ELISA檢測值由0.264 8升高至0.713 3，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與AA組相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml各組中的IL-8的ELISA檢測值分別由0.713 3降低至0.528 9、0.507 6、0.501 1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。以上結(jié)果提示PF具有抑制AA大鼠病理的作用。

表2大鼠足爪腫脹評分

Tab.2Ratpawswellingscores

GroupsDay 16Day 20Day 24Day 28Day 32Normal group0.5±0.410.4±0.430.5±0.460.4±0.470.7±0.48AA group4.1±0.781)4.3±0.761)5.4±0.611)5.9±0.771)5.8±0.561)PF 5 mg/kg2.9±0.682)3.2±0.792)3.9±0.712)4.5±0.752)4.5±0.582)PF 10 mg/kg2.6±0.652)2.8±0.732)3.5±0.712)4.3±0.632)4.3±0.742)PF 20 mg/kg2.6±0.512)2.7±0.532)3.4±0.612)4.0±0.592)4.3±0.712)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05;compared with AA group,2)P<0.05,n=10.

圖1 PF抑制AA大鼠FLS Fibronectin基因表達Fig.1 PF inhibits expression of Fibronectin in AA FLSNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

圖2 PF抑制AA大鼠FLS IL-8表達Fig.2 PF inhibits expression of IL-8 in AA FLSNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

2.4PF抑制AA大鼠FLS增殖 PF加藥后48 h，采用MTT檢測正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml組、PBS組大鼠FLS增殖活力。結(jié)果顯示，與正常組相比，AA組大鼠FLS的MTT檢測值由0.095 6升高至0.410 8，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與AA組相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三個組的MTT檢測值顯著降低，分別由0.410 8降低至0.308 8、0.291 7、0.290 9，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。提示PF具有抑制AA大鼠FLS增殖的作用。

圖3 MTT檢測PF對AA大鼠FLS增殖的影響Fig.3 MTT was used to detect effect of PF on FLS proliferationNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

圖4 Real time qPCR檢測PF對AA大鼠Bax、Caspase 3、Bcl-2表達的影響Fig.4 Real time qPCR was used to detect expression of Bax,Caspase 3,Bcl-2 in AA ratsNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with AA group，#.P<0.05,n=10.

2.5PF促進AA大鼠FLS凋亡 PF加藥后48 h，采用Real time qPCR檢測Bax、Caspase 3、Bcl-2在正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml組、PBS組大鼠FLS中的表達。結(jié)果顯示，與正常組相比，Bax、Caspase 3在AA組大鼠FLS中相對表達量分別由1降低至0.4365、0.7036，Bcl-2在AA組大鼠FLS中相對表達量由1升高至3.216 6，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與AA組相比，Bax在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三組中表達顯著升高，分別由0.436 5升高至0.795 2、0.7911、0.814 7，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Caspase 3在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三組中表達也顯著升高，分別由0.703 6升高至0.902 6、0.909 7、0.922 1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Bcl-2在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三組中表達顯著降低，分別由3.216 6降低至2.248 5、2.233 9、2.105 7，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。以上結(jié)果提示PF對AA大鼠FLS凋亡具有促進作用，可能是通過促進AA大鼠FLS凋亡、抑制增殖達到治療AA大鼠的作用。

3 討論

盡管目前的研究較深入地闡述了RA的病理機制，但是RA發(fā)病機制仍然未能完全闡明，特別是持續(xù)的滑膜炎癥和異常的滑膜增殖[6]。研究表明各種內(nèi)源性和外源性抗原在不同程度上引發(fā)RA發(fā)生發(fā)展。內(nèi)源抗原可能源自關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致的組織損傷，或者是細胞凋亡釋放的自身固有而未被自身免疫系統(tǒng)識別的成分[7]。目前認為FLS的異常增殖活化在RA病理機制中起關(guān)鍵作用[8]。例如增生的FLS釋放IL-6、IL-8、IL-15、基質(zhì)細胞因子SDF-1等細胞因子和趨化因子[9]。FLS能夠合成纖維連接蛋白、細胞黏附分子等細胞外基質(zhì)蛋白，這些蛋白分子招募和駐留白細胞，進一步加重了病情。FLS同時促進B淋巴細胞分化，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、基質(zhì)降解酶，增強軟骨的侵蝕和降解，最終導(dǎo)致骨的損壞和關(guān)節(jié)功能的破壞[10]。近年研究表明FLS參與了RA軟骨侵蝕過程關(guān)鍵調(diào)控因子的合成釋放，表達于FLS和T細胞上的NFκB配體RANKL與表達于單核細胞上的共用受體RANK相互作用起始了破骨細胞的分化和骨的重吸收，因此，F(xiàn)LS調(diào)控了具有侵蝕軟骨的血管翳的形成。FLS具有干細胞的增生特性，滑膜增生可能源于關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致的滑膜細胞代償性再生[11]。AA大鼠病理特點與人RA相似，是常用的RA研究動物模型。同時，鑒于FLS在RA發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用，本試驗分離培養(yǎng)AA大鼠FLS，以AA大鼠FLS為研究對象，檢測相關(guān)分子的表達差異，探索PF對RA病理機制的影響。芍藥苷來源于毛莨科植物芍藥根、牡丹根等，主要包括羥基芍藥甙、芍藥花甙、芍藥內(nèi)酯甙、苯甲酰芍藥甙等，具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、擴張血管、解熱解痙、利尿等作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，AA組大鼠的足爪腫脹評分明顯升高，與AA組相比，各治療組的足爪腫脹評分都顯著降低，說明PF對AA大鼠有一定的治療作用。在各組FLS培養(yǎng)液中加入PF 48 h后，采用Real time qPCR檢測Fibronectin在正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml組、PBS組大鼠FLS中的表達。結(jié)果顯示，與正常組相比，F(xiàn)ibronectin在AA組大鼠FLS中相對表達量顯著升高，與AA組相比，F(xiàn)ibronectin在PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三組中表達顯著降低。ELISA檢測IL-8在正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml、PBS組大鼠FLS中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，AA組IL-8的ELISA檢測值顯著升高，與AA組相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml各組中的IL-8的ELISA檢測值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示PF可能具有抑制AA大鼠病理機制的作用。

采用MTT檢測正常組、AA組、PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml組、PBS組大鼠FLS增殖活力。結(jié)果顯示，與正常組相比，AA組大鼠FLS的MTT檢測值顯著升高，與AA組相比，PF 100 μg/ml、PF 200 μg/ml、PF 400 μg/ml三組的MTT檢測值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義，說明PF具有抑制AA大鼠FLS增殖的作用。促凋亡基因Bax和細胞凋亡因子Caspase 3基因的激活表達促進細胞的凋亡，抗凋亡基因Bcl-2激活表達抑制細胞的凋亡，起到促進細胞增殖的作用[12]。在培養(yǎng)的各組FLS中加入PF 48 h后，采用Real time qPCR檢測PF加藥對AA大鼠FLS中Bax、Caspase 3和Bcl-2表達的影響。結(jié)果表明，PF具有顯著上調(diào)Bax、Caspase 3表達，抑制Bcl-2表達的作用。PF可能是通過抑制FLS增殖、促進FLS凋亡的機制起到抑制AA大鼠病理發(fā)展的作用。本試驗以FLS增殖凋亡為研究切入點，進一步闡明PF對RA動物模型病理影響的分子機制，為芍藥苷藥理藥效研究提供了新的實驗基礎(chǔ)，為RA疾病防治提供新思路新方法。