賈 祁，李 麗，石麗君，吳 迎

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CaN/NFAT信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)改善高血壓心肌肥大中的作用

賈 祁，李 麗，石麗君，吳 迎

北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院, 北京 100084

目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertension rat，SHR）心肌鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T細(xì)胞因子（calcineurin/nuclear factor of activated T cells, CaN/NFAT）信號(hào)通路的影響，以及A激酶錨定蛋白150（A-kinase anchoring protein 150，AKAP150）在其中的作用。方法：12周齡雄性SHR以及正常血壓對(duì)照組大鼠（Wistar-Kyoto rat，WKY），隨機(jī)分為正常血壓安靜組（WKY-SED），正常血壓運(yùn)動(dòng)組（WKY-EX），高血壓安靜組（SHR-SED），高血壓運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX）。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行12周中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。12周后取心臟，HE染色、Langendorff離體心臟灌流、免疫組化、免疫細(xì)胞熒光、Western blot等方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：1）經(jīng)12周有氧運(yùn)動(dòng)，WKY和SHR運(yùn)動(dòng)組收縮壓均顯著低于各自安靜組；2）與WKY-SED組相比，SHR-SED組左心室內(nèi)壓上升最大速率（maximal rate of increase in left ventricular pressure，+dp/dtmax）、左心室內(nèi)壓下降最大速率（maximal rate of decrease in left ventricular pressure， -dp/dtmax）絕對(duì)值顯著降低，SHR-EX組與SHR-SED組相比，+dp/dtmax、-dp/dtmax絕對(duì)值顯著升高（＜0.01），左心室收縮壓力（left ventricular systolic pressure，LVSP）升高（＜0.01），LVSP-LVDP 升高（＜0.01）；3）SHR-SED組CaN和AKAP150的熒光強(qiáng)度高于WKY-SED組（＜0.01），CaN表達(dá)高于SHR-EX組（＜0.01）；SHR-EX組AKAP150的熒光強(qiáng)度高于SHR-SED組（＜0.01）；4）SHR-SED組CaN、GATA結(jié)合蛋白4（GATA bind protein，GATA4）及AKAP150的蛋白表達(dá)高于WKY-SED組（＜0.01），p-NFATc3/NFATc3的比值顯著低于WKY-SED組；SHR-EX組CaN、GATA4的表達(dá)低于SHR-SED組（＜0.01），p-NFATc3/NFATc3的比值和AKAP150的表達(dá)均高于SHR-SED組。結(jié)論：有氧運(yùn)動(dòng)下調(diào)SHR心臟CaN/NFAT信號(hào)通路活性、增加調(diào)節(jié)因子AKAP150的表達(dá)，是運(yùn)動(dòng)改善其心臟肥大的分子機(jī)制之一。

高血壓心肌肥大；CaN/NFAT信號(hào)通路；有氧運(yùn)動(dòng)；AKAP150

高血壓是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險(xiǎn)因素，迄今仍然是心血管疾病死亡的主要原因[9,20]。在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳遞途徑是誘導(dǎo)心肌肥大的最重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[10]。胞內(nèi)Ca2+增加是導(dǎo)致心肌肥大的最基本信號(hào)，是引起初級(jí)和次級(jí)應(yīng)答基因變化的一個(gè)始動(dòng)因素和媒介，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T細(xì)胞因子（calcineurin/nuclear factor of activated T cells, CaN/NFAT）信號(hào)通路在胞內(nèi)Ca2+升高誘導(dǎo)的心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用[4,20,33]。活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFATs）是T細(xì)胞激活時(shí)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄因子，它們會(huì)吞噬T細(xì)胞增殖所需的細(xì)胞因子，并在T細(xì)胞反應(yīng)中刺激細(xì)胞生長(zhǎng)[16]。哺乳動(dòng)物心臟主要存在NFATc3，NFATc3受Ca2+和CaN的調(diào)控，去磷酸化后暴露核定位信號(hào)，在細(xì)胞核中與轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4（GATA bind protein 4，GATA4）結(jié)合，而GATA4是介入心臟正常生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能調(diào)節(jié)心臟基因表達(dá)，NFATc3與GATA4結(jié)合后引起與早期免疫反應(yīng)有關(guān)的基因活化，胚胎基因被激活，導(dǎo)致一系列病理變化，形成病理性心肌肥大[5,13,37]。AKAP150（A-kinase anchoring protein 150）為A型錨定蛋白家族中的一員，參與心肌內(nèi)鈣離子循環(huán)[21]及調(diào)節(jié)β1-腎上腺受體（Beta 1-adrenal receptors，β1-AR）信號(hào)強(qiáng)度[22]，且存在CaN的結(jié)合抑制域，過表達(dá)此抑制域可以減弱CaN/NFAT信號(hào)通路依賴的心臟肥大[6]。

大量研究表明[11,14,30,35]，運(yùn)動(dòng)能夠改善壓力負(fù)荷等病理刺激引起的心肌肥大，但是，在自發(fā)性高血壓心肌肥大進(jìn)展中，有氧運(yùn)動(dòng)怎樣改善這一病理過程以及是否通過調(diào)控CaN/NFAT信號(hào)通路目前還不明確，CaN的調(diào)控因子AKAP150在其中的作用也不清楚。本研究旨在從整體、器官、細(xì)胞及分子水平上觀察有氧運(yùn)動(dòng)與心肌肥大的關(guān)系，并進(jìn)一步研究CaN依賴的信號(hào)通路在大鼠心肌肥大中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，藉此為高血壓心肌肥大提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 大鼠運(yùn)動(dòng)模型的制備、實(shí)驗(yàn)分組

12周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertension rat, SHR）以及正常血壓對(duì)照組（wistar-kyoto，WKY），購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；隨機(jī)分為正常血壓安靜組（WKY-SED），正常血壓運(yùn)動(dòng)組（WKY-EX），高血壓安靜組（SHR-SED）和高血壓運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX），每組各12只。

1.2 心臟離體灌流實(shí)驗(yàn)測(cè)定心臟功能

采用ML870B2 Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)檢測(cè)大鼠心臟功能，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg），麻醉后快速取心臟掛于主動(dòng)脈灌注管上固定，灌流液（mmol/L，NaCl 120；KCl 45；CaCl21.2；MgCl26H2O 1.2；KH2PO41.2；NaHCO320；Glucose 10；KOH調(diào)pH至7.4）以10ml/min的速度灌流，恢復(fù)自主跳動(dòng)并穩(wěn)定后插入球囊，連接電極，記錄心室壓、灌注壓、心臟表面心電圖等指標(biāo)。所有指標(biāo)采用Labchart7分析處理。

1.3 病理學(xué)指標(biāo)

開胸取心臟，迅速剪去多余組織，稱取心臟重量（heart weight，HW）；沿房室環(huán)剪去心房及右室游離壁，稱取左心室重量（left ventricular weight，LVW），計(jì)算LVW與HW之比即為左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）。最后置于4％多聚甲醛固定液中固定，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行HE染色。橫切組織，切片厚5μm；經(jīng)脫蠟、水化、染色、脫水、透明、封片等步驟后在鏡下拍照。

將處理好的左心室放在4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，分別在20%和30%的蔗糖溶液中脫水12 h，將心臟取出，組織被OCT包裹迅速置于液氮中冷卻，冠狀切片。經(jīng)免疫組化染色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精復(fù)染、二甲苯透明和封片后，每片隨機(jī)抽取5個(gè)不相重疊的視野，1X71倒置相差顯微鏡（Olympus，Japan）拍照。Image Pro Plus軟件進(jìn)行平均光密度分析。

1.4 心肌細(xì)胞急性分離

麻醉后迅速取心置于4℃無鈣臺(tái)式液中（mmol/L，NaCl 135；KCl 5.4；MgCl21；NaH2PO40.33；Glucose 10；HEPES 5；pH用NaOH調(diào)至7.4，充混合氣飽和）剪除多余組織。迅速掛于Langendorff離體心臟灌流儀上，無鈣臺(tái)式液灌流20 min，流速8 ml/min。分離心肌細(xì)胞：使用Ⅱ型膠原酶配制50 ml酶液，持續(xù)灌流30 min左右，剪下心尖部，置于保存液中，將細(xì)胞從組織中刮落。200目過濾網(wǎng)過濾入10 ml離心管中。加入保存液至10 ml靜置15 min，棄上清，如此反復(fù)靜置3次。

1.5 細(xì)胞免疫熒光

急性分離的心肌細(xì)胞4℃貼壁60 min后，4%多聚甲醛固定30 min，加入0.2%Triton X-100膜打孔10 min，10%山羊血清封閉后，分別滴加一抗Rabbit Polyclonal to Anti-CaN（濃度為1∶250，Alomone, Israel），Rabbit Polyclonal to Anti-AKAP150（濃度為1∶250，Alomone, Israel），4℃過夜。次日避光加入熒光二抗Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG antibody（濃度為1∶500）室溫孵育1 h后，用抗淬滅封片劑ProLong Gold Antifade Mountant封片，室溫避光干燥保存，24 h后可用激光共聚焦系統(tǒng)（SP5TCS, Leica, Germany）采集信號(hào)。

1.6 蛋白免疫印跡分析

每組選取6只大鼠進(jìn)行心肌CaN、NFATc3、p-NFATc3、GATA4和AKAP150蛋白免疫印跡分析，因NFATc3去磷酸化無法檢測(cè)，故對(duì)p-NFATc3/NFATc3進(jìn)行分析。大鼠腹腔麻醉，將處理好的左心室放入-80 ℃冰箱保存。稱取100 mg組織，迅速加入500μL RIPA裂解液，用勻漿器在冰水浴中勻漿10次，每次4～5 s，間隔4～5 s。將勻漿液于4 ℃以13 000 g離心30 min，取上清待測(cè)。按照常規(guī)操作進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定、電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉2 h。加入用0.01 mol/L TBST稀釋的一抗(anti-CaN 1:400，GAPDH 1： 1 000，anti-NFATc3 1:250，anti-p-NFATc3 1:500，anti-AKAP150 1:400，anti-GATA4 1:1 000)，室溫脫色搖床上搖動(dòng)孵育1 h，4 ℃孵育過夜。0.01 mol/L TBST漂洗3次，加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育1 h。免疫蛋白活性由增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，用Image LabTM Software軟件進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 體重與血壓

有氧運(yùn)動(dòng)前WKY-EX組和SHR-EX組收縮壓與各自安靜組比較均無顯著性差異，SHR組的收縮壓為209±14 mmHg，顯著高于WKY組（144±13 mmHg,＜0.01）；12周有氧運(yùn)動(dòng)后，WKY-SED組（156±12 mmHg）高于WKY-EX組收縮壓（132±14 mmHg，＜0.05）；SHR-SED組收縮壓（222±11 mmHg）顯著高于WKY-SED組（156±12 mmHg，＜0.01）；SHR-SED組收縮壓顯著高于SHR-EX組（196±18 mmHg，＜0.01），說明經(jīng)過有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后自發(fā)性高血壓大鼠的血壓有顯著的改善。

2.2 運(yùn)動(dòng)改善SHR心臟功能

左心室內(nèi)壓上升最大速率（maximal rate of increase in left ventricular pressure，+dp/dtmax）和左心室收縮壓力（left ventricular systolic pressure，LVSP），可以評(píng)估心臟收縮功能；反映心臟舒張功能的指標(biāo)包括左心室內(nèi)壓下降最大速率（maximal rate of decrease in left ventricular pressure，-dp/dtmax）和左心室舒張壓力（left ventricular diastolic pressure，LVDP）。利用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)的測(cè)試，結(jié)果顯示：SHR-SED組與WKY-SED組相比，+dp/dtmax降低（＜0.01），-dp/dtmax絕對(duì)值降低（＜0.05），LVSP降低（＜0.01），LVSP-LVDP降低（＜0.05），表明自發(fā)性高血壓大鼠的心臟功能顯著較正常大鼠降低；12周有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組離體心臟功能明顯好于SHR-SED組，結(jié)果為+dp/dtmax升高（＜0.01），-dp/dtmax絕對(duì)值升高（＜0.05），LVSP升高（＜0.01），LVSP-LVDP升高（＜0.01）。結(jié)果如圖1、表1所示。

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠心臟形態(tài)的影響

各組大鼠心臟大體觀可見圖2A。利用HE染色的方法觀察各組大鼠心肌形態(tài)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SHR-SED組心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間排列疏松，心肌纖維斷裂、融合，個(gè)別視野心肌間質(zhì)纖維化，橫截面上可見心肌細(xì)胞直徑增寬，單個(gè)心肌細(xì)胞面積明顯增加；SHR-EX組的心肌細(xì)胞較安靜組排列更整齊、致密，細(xì)胞橫截面積及直徑都相對(duì)減?。▓D2B）。

以LVW/HW比值作為心臟肥大指數(shù)反映大鼠心肌肥大的程度，結(jié)果顯示：SHR-SED組、SHR-EX組與WKY-SED組相比肥大指數(shù)明顯增加（表2）。

圖1 離體心臟灌流左心室壓力與最大上升/下降速率圖

Figure1. Graph of Left Ventricular Pressure and Maximum Increase/Decrease Rate

注：圖A為各組左心室壓力-時(shí)間曲線；圖B為各組dp/dt曲線圖。

表1 各組大鼠離體心臟功能指標(biāo)

注：與WKY-SED相比，#＜0.05，##＜0.01；與SHR-SED相比，*＜0.05，**＜0.01；下同。

圖2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)的影響

Figure 2. Effects of Aerobic Exercise on the Heart Structure of Rats

注：圖A為各組大鼠心臟大體觀察，標(biāo)尺=5 mm；圖B為各組大鼠心肌HE染色圖(×400)，標(biāo)尺=20 μm。

表2 各組心臟肥大指數(shù)

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠心肌信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

利用Western blot技術(shù)檢測(cè)了各組大鼠心肌內(nèi)CaN的蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示：SHR-SED組高于WKY-SED組（＜0.01）；SHR-SED組高于SHR-EX組（＜0.01），WKY-SED組與WKR-EX組沒有顯著性差異，提示，SHR-SED組的CaN的表達(dá)顯著增多，而經(jīng)過有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后CaN的表達(dá)顯著下調(diào)。各組大鼠NFATc3總蛋白的表達(dá)沒有顯著性差異，但WKY-SED組p-NFATc3/NFATc3高于SHR-SED組（＜0.05）；SHR-EX組p-NFATc3/NFATc3高于SHR-SED組（＜0.05），表明自發(fā)性高血壓大鼠心肌中NFATc3去磷酸化顯著高于正常血壓安靜組，而經(jīng)過有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后自發(fā)性高血壓大鼠心肌中NFATc3的去磷酸化減少。檢測(cè)各組大鼠心肌中GATA4的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：SHR-SED組高于WKY-SED組（＜0.01）；SHR-SED組高于SHR-EX組（＜0.05），故SHR-SED組心肌中GATA4的表達(dá)顯著上調(diào)，而有氧運(yùn)動(dòng)有效下調(diào)其表達(dá)。檢測(cè)了各組大鼠心肌內(nèi)AKAP 150的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：SHR-SED組高于WKY-SED組（＜0.01）；SHR-EX組高于SHR-SED組（＜0.01）；WKY-EX組高于WKY-SED組。以上結(jié)果表明，自發(fā)性高血壓大鼠的AKAP150的表達(dá)顯著增多，而有氧運(yùn)動(dòng)的干預(yù)不管是在自發(fā)性高血壓大鼠或者是正常血壓大鼠的心肌中均上調(diào)了AKAP150的表達(dá)（＜0.01，圖3）

2.5 運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠心肌組織CaN、AKAP150表達(dá)和分布的影響

免疫組織化學(xué)方法觀察了各組大鼠CaN在左心室的表達(dá)和分布，結(jié)果顯示：SHR-SED組CaN陽(yáng)性強(qiáng)度高于WKY-SED組（＜0.01）；SHR-SED組高于SHR-EX組（＜0.01）；AKAP150的結(jié)果顯示：SHR-SED組陽(yáng)性強(qiáng)度高于WKY-SED組（＜0.01）；WKY-EX組高于WKY-SED組（＜0.01）；SHR-EX組高于SHR-SED組（＜0.01，圖4）。以上結(jié)果表明，自發(fā)性高血壓大鼠心肌中CaN和AKAP150的表達(dá)較正常血壓組顯著增多，而有氧運(yùn)動(dòng)的干預(yù)能有效降低CaN的表達(dá)，上調(diào)AKAP150的表達(dá)。

2.6 運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠左心室心肌細(xì)胞內(nèi)CaN和AKAP150表達(dá)及分布的影響

免疫熒光技術(shù)及激光共聚焦成像觀察各組大鼠心臟單個(gè)心肌細(xì)胞CaN和AKAP150表達(dá)及分布。如圖5A所示，CaN顯示為紅色熒光；AKAP150顯示為綠色熒光，二者共定位顯示為黃色熒光，如圖5顯示，SHR-SED組的黃色熒光最為明顯，說明CaN與AKAP150的共定位最多。分析熒光強(qiáng)度表明，與WKY-SED組相比，SHR-SED組、WKY-EX組CaN和AKAP150熒光強(qiáng)度顯著升高（＜0.01，圖5B、C）；與SHR-SED組相比，SHR-EX組CaN熒光強(qiáng)度顯著下降（＜0.01），AKAP150顯著升高（＜0.01，圖5C）。

圖3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠心肌信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

Figure 3. Effect of Aerobic Exercise on Protein Expression of Signaling Pathway in Rats Myocardial

注：圖A為各組大鼠心肌CaN、GATA4、AKAP150、NFATc3、p-NFATc3及對(duì)應(yīng)GAPDH的Western blot圖；圖B、C、D、E分別為CaN、GATA4、AKAP150、p-NFATc3/NFATc3蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與WKY-SED相比，#＜0.05，##＜0.01；與SHR-SED相比，*＜0.05，**＜0.01；下同。

圖4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠心肌CaN、AKAP150表達(dá)及分布的影響

Figure 4. Protein Expression and Distribution of CaN、AKAP150 in Rats Myocardial

注：圖A、B分別是各組大鼠心肌CaN、AKAP150的蛋白免疫組化染色圖；圖C、D分別CaN、AKAP150的蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。棕色顆粒代表陽(yáng)性反應(yīng)，標(biāo)尺=50 μm。

圖5 各組大鼠心肌細(xì)胞CaN、AKAP150蛋白表達(dá)與分布

Figure 5. Expression and Distribution of CaN and AKAP150 in Rats Myocardial Cells

注：圖A為各組熒光標(biāo)記心肌細(xì)胞代表圖，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核；圖B、C為各組細(xì)胞CaN、AKAP150蛋白相對(duì)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。

3 討論

本研究采用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)研究心臟功能，它的優(yōu)勢(shì)在于排除了神經(jīng)、體液因素以及心臟前后負(fù)荷對(duì)心功能的影響[31]。該設(shè)備測(cè)得反映心臟功能的指標(biāo)主要是左心室內(nèi)壓最大速率（maximal rate of increase in left ventricular pressure, ±dp/dtmax）和LVSP，其中，+dp/dtmax是評(píng)估心臟收縮功能的常用指標(biāo)，可以反映心肌收縮性。-dp/dtmax可反映左心室的充盈程度、舒張功能及心室順應(yīng)性，常作為心肌舒張參數(shù)和評(píng)估心肌早期舒張功能改變的敏感指標(biāo)[15]。有研究表明，SHR 8周齡時(shí)左心室收縮功能開始減退，12周齡時(shí)左心室舒張功能出現(xiàn)異常[17]，故本研究所選擇的12周齡SHR能夠比較全面的了解其心功能的病理生理發(fā)展進(jìn)程及干預(yù)效果。本研究顯示，SHR-SED與WKY-SED組相比±dp/dtmax絕對(duì)值下降，這說明此階段已出現(xiàn)明顯的舒張功能損傷；SHR-EX組±dp/dtmax絕對(duì)值、LVSP、LVSP-LVDP升高，收舒功能均得到有效改善，表明有氧運(yùn)動(dòng)能有效改善高血壓大鼠心臟功能。HE染色與肥大指數(shù)的結(jié)果均顯示了SHR組心臟結(jié)構(gòu)的變化。綜上可知，從心臟大體形態(tài)、病理組織學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)等多方面表明SHR心肌肥大明顯，心臟功能嚴(yán)重?fù)p害，而在12周規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)后從結(jié)構(gòu)和功能方面都有明顯的改善。

許多研究表明，CaN/NFAT信號(hào)通路在壓力負(fù)荷引起的心肌肥大中有重要的作用[23,32,38]。CaN過表達(dá)能夠明顯增加心臟大小，并最終誘導(dǎo)心衰[25]；使用CaN抑制劑后，抑制劑組心肌肥大較對(duì)照組明顯改善[26]；敲除CaN能夠有效抑制肥大基因的表達(dá)，并且在一定程度上改善心肌肥大的病理進(jìn)程[36]。而有氧運(yùn)動(dòng)能夠減少心衰[18]、肥厚型心肌病[2]等心肌內(nèi)CaN/NFAT信號(hào)通路的活化而改善心臟功能。Oliveria等[29]研究報(bào)道，運(yùn)動(dòng)可以減弱心肌細(xì)胞內(nèi)NFATc3的轉(zhuǎn)移，降低肥大因子GATA4的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明[1]，有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效抑制腸系膜動(dòng)脈中CaN/NFAT信號(hào)通路的表達(dá)，改善血管功能。在此基礎(chǔ)上本研究針對(duì)高血壓對(duì)于心臟的影響進(jìn)行進(jìn)一步的研究，結(jié)果顯示，SHR-SED組CaN及其下游信號(hào)GATA4的蛋白表達(dá)均顯著高于WKY-SED組，p-NFATc3/NFATc3的比值顯著低于WKY-SED組，即表示SHR-SED組心肌中NFATc3去磷酸化增多，免疫組化顯示SHR-SED組CaN的分布較WKY-SED組更密集，陽(yáng)性顯色顯著增多。表明CaN/NFAT信號(hào)通路是導(dǎo)致SHR心肌肥大的機(jī)制之一。SHR-EX組CaN/NFAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及NFATc3的去磷酸化均顯著低于SHR-SED組，這說明有氧運(yùn)動(dòng)有效降低了CaN/NFAT信號(hào)通路各蛋白的活性，而CaN/NFAT信號(hào)通路為病理性心肌肥大必不可少的致病因素，從而可知，有氧運(yùn)動(dòng)降低了SHR對(duì)于病理性刺激引起的心肌肥大的應(yīng)答，改善了SHR病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展。而在正常血壓組的以往研究表明，由運(yùn)動(dòng)形成的生理性心肌肥大也存在CaN/NFAT信號(hào)通路的參與，但根據(jù)不同的運(yùn)動(dòng)方式和強(qiáng)度有著不同的變化[34]。本研究結(jié)果顯示，WKY-EX組CaN的熒光強(qiáng)度較WKY-SED組增加，但是CaN/NFAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)與WKY-SED組均無顯著差異，提示，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)正常血壓大鼠心肌中CaN/NFAT信號(hào)通路的影響較小。

AKAP150在心臟中的作用復(fù)雜，且因不同病理性刺激，可以結(jié)合不同的酶而調(diào)節(jié)產(chǎn)生不同的細(xì)胞功能[7]。有研究表明，AKAP150能夠影響心臟重塑。例如交感神經(jīng)刺激下培養(yǎng)的成年心肌細(xì)胞中，AKAP150與caveolin-3相互作用影響心肌細(xì)胞中鈣瞬態(tài)的產(chǎn)生，由此推斷它可能參與心肌細(xì)胞鈣離子的循環(huán)[27]，因?yàn)樾募〖?xì)胞中鈣離子的增多正是引起心肌肥大的中心環(huán)節(jié)[10]。早期研究發(fā)現(xiàn)，AKAP150存在CaN的結(jié)合域，可以非競(jìng)爭(zhēng)性抑制CaN的活性，在高表達(dá)此結(jié)合域的情況下，能夠抑制NFAT依賴的心肌肥大[3]。在敲除AKAP150的轉(zhuǎn)基因小鼠中，CaN的活性增加，出現(xiàn)顯著的心臟肥大和心功能不全[24]。此外，AKAP150與CaN的結(jié)合對(duì)于β1-AR的循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)有非常重要的作用，使AKAP150通過調(diào)控心肌中β1-AR的信號(hào)強(qiáng)度來起到保護(hù)心臟的作用[2,22]。心肌梗死后，AKAP150與CaN形成的復(fù)合物可調(diào)控NFAT的核轉(zhuǎn)位，下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)Kv通道[28]。提示，不同的病理性刺激下，AKAP150可能可以錨定CaN產(chǎn)生不同的作用。自發(fā)性高血壓中AKAP150的研究較少，有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)其的作用也鮮有報(bào)道，但其與CaN/NFAT信號(hào)通路又有著密切的關(guān)系，故本研究對(duì)此進(jìn)行了一些表象的研究。早期研究表明AKAP150存在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制CaN的抑制性結(jié)合域[3]，而本研究結(jié)果顯示，SHR-EX組CaN表達(dá)顯著減少，AKAP150的表達(dá)顯著高于SHR-SED組，CaN與AKAP150的結(jié)合增多，故可推測(cè)AKAP150的作用機(jī)制為通過結(jié)合CaN，抑制后者活性以保護(hù)心臟，而運(yùn)動(dòng)后AKAP150表達(dá)顯著增多提示，有氧運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)AKAP150的表達(dá)，改善心肌肥大的病理進(jìn)程。而本研究結(jié)果同樣顯示，SHR-SED組AKAP150的蛋白表達(dá)顯著多于WKY-SED組，以往研究中并未有關(guān)于自發(fā)性高血壓大鼠心肌中AKAP150變化的研究，但是有研究發(fā)現(xiàn)，敲除AKAP150的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)心臟肥大和心功能不全[10]；AKAP150敲除小鼠會(huì)產(chǎn)生年齡依賴性的心臟肥大、血管腔擴(kuò)大和心功能障礙[12]；而過表達(dá)AKAP150能夠減弱限制型心肌病轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌肥大[6]，以上可以得出AKAP150作為心臟保護(hù)作用的依據(jù)。故結(jié)合以往研究結(jié)果提示，在SHR心肌肥大代償期，AKAP150有可能為代償性增多，達(dá)到一種負(fù)反饋的調(diào)節(jié)作用，但若要詳細(xì)系統(tǒng)的解釋此結(jié)果還需進(jìn)一步研究求證。另一方面本研究顯示，WKY-EX組與WKY-SED組相比AKAP150蛋白表達(dá)明顯增多，提示在生理性心肌肥大中，AKAP150可能參與其他信號(hào)通路來調(diào)控心肌細(xì)胞功能，其調(diào)控機(jī)制還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

本研究表明，6月齡SHR-SED組表現(xiàn)出明顯的心臟肥大，心臟收縮功能和舒張功能明顯下降，心臟質(zhì)量顯著大于正常對(duì)照組，心肌組織排列紊亂、稀疏，心肌纖維斷裂等，心肌細(xì)胞明顯肥大，而經(jīng)過12周有氧運(yùn)動(dòng)的SHR-EX組心臟結(jié)構(gòu)、收縮功能和舒張功能較安靜組均有顯著改善。而在自發(fā)性高血壓引起的心臟肥大中CaN/NFAT信號(hào)通路的激活，是對(duì)病理性刺激的一種應(yīng)答反應(yīng)，長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能有效降低此信號(hào)通路的活性，并同時(shí)增加AKAP150的表達(dá)，抑制CaN的活性，從而減少病理性應(yīng)答，改善心臟功能。

4 結(jié)論

規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)通過下調(diào)6月齡SHR心臟CaN/NFAT信號(hào)通路活性、增加調(diào)節(jié)因子AKAP150的表達(dá)，改善心臟功能，是運(yùn)動(dòng)改善其心臟肥大的分子機(jī)制之一。

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The Role of CaN/NFAT Signaling Pathway in Aerobic Exercise-induced Improvement of Cardiac Hypertrophy in Hypertension

JIA Qi, LI Li, SHI Li-jun, WU Ying

Beijing Sport University, Beijing 100084, China.

Objective: The purpose of this study was to investigate the effects of aerobic exercise on the CaN/NFAT signaling pathway in SHR myocardial cells, and the role of the AKAP150. Methods: 12-week-old male SHR and WKY rats were randomly assigned to sedentary groups (SHR-SED, WKY-SED) and exercise training groups (SHR-EX, WKY-EX). Exercise groups were performed a 12-week moderate-intensity treadmill running. After 12 weeks, the myocardial cells were enzymatically isolated. The experimental methods include HE staining, the Langendorff technique of isolated heart perfusion, immunohistochemistry, immune cell fluorescence, Western blot. Results: 1) After 12 weeks of exercise, SBP in both WKY-EX and SHR-EX were significantly lower than that of their sedentary counterparts. 2) Compared with the WKY-SED group, the SHR-SED group +dp/dtmax, -dp/dtmaxsignificantly decreased, and the SHR-EX group was significantly higher than the SHR-SED group, +dp/dtmaxsignificantly increased, -dp/dtmaxdecreased (＜0.01), LVSP increased (＜0.01). 3) The fluorescence intensity of CaN and AKAP150 in the SHR-SED group was higher than WKY-SED group (＜0.01), and the fluorescence intensity of the SHR-EX group AKAP150 was higher than SHR-SED group (＜ 0.01), and the expression of CaN was lower than the SHR-SED group (＜0.01). 4) The protein expression of CaN and AKAP150 in the SHR-SED group was higher than that in the WKY-SED group (＜0.01). The expression of p-NFAT in the SHR-SED group was significantly lower than that the WKY-SED group. The expression of the SHR-EX group CaN be lower than the SHR-SED group (＜ 0.01), and the expression of p-NFAT and AKAP150 is higher than the SHR-SED group. Conclusion: Aerobic exercise reduced the activity of the CaN/NFAT signaling pathway and increased the expression of AKAP150 in the SHR myocardial, which is one of the molecular mechanisms to improve the hypertrophy of the heart.

G804.5

A

2017-12-19；

2018-12-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31771312);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2017QN010)。

賈祁,女,碩士研究生,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)和心血管生理學(xué),Email: 980712411@qq.com。

吳迎,男,講師,博士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管生理學(xué),Email:wuying@bsu.edu.cn。

1000-677X(2018)12-0045-08

10.16469/j.css.201812005