胰腺癌分子分型的研究進(jìn)展

孫晨 蔣慧 鄭建明

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院病理科，上海 200433

【提要】 胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是世界上惡性程度最高的腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐步升高，但其生存率并未有明顯提高。PDAC表現(xiàn)為顯著的異質(zhì)性，而這為其分子分型提供了依據(jù)。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，PDAC的DNA、RNA、蛋白質(zhì)等的突變模式也越來越清楚。本文旨在總結(jié)近年來PDAC的分子分型的研究進(jìn)展。

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是惡性程度最高的腫瘤之一，預(yù)后極差，5年生存率<10%[1]。手術(shù)切除輔以化療是唯一的治愈性方案，然而只有15%～20%的患者在診斷時(shí)可以進(jìn)行手術(shù)并且即使在成功切除后，預(yù)期的5年生存率也<20%[2]。1999年，美國國家癌癥研究所提出通過分子分析技術(shù)，以腫瘤的分子特征為依據(jù)進(jìn)行分類，首次提出了腫瘤分型這個(gè)概念。而后二代測序技術(shù)提供了腫瘤DNA、RNA、蛋白質(zhì)和表觀遺傳等突變資料，這些資料增加了對腫瘤異質(zhì)性的理解，也為腫瘤分類提供了新方法[3]。胰腺癌分子分型的提出對靶向療法、預(yù)后評估、個(gè)體化治療的發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用，本文旨在對近年來國際上提出的胰腺癌分子分型進(jìn)行綜述。

一、以基因和染色體突變?yōu)榛A(chǔ)的分型

早期研究證明，在PDAC中最常見的突變基因是KRAS、SMAD4、TP53以及CDKN2A/B，后通過大量基因測序、相對基因組雜交等技術(shù)，ARID1A、GATA6、SF3B1以及TGFBR2等基因的突變也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[4-6]。Shindo等[7]對854例PDAC患者進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有3.9%的患者發(fā)生了生殖系突變，而其中最常見的突變基因是BRCA1/2、PALB2、CDKN2A、TP53、MLH1、ATM。

Waddell等[8]通過對100例PDAC樣本進(jìn)行全基因組測序和拷貝數(shù)變異分析，以染色體結(jié)構(gòu)改變和涉及的分子機(jī)制為基礎(chǔ)將其分為4種亞型，分別為：(1)穩(wěn)定型(20%)。腫瘤基因組有<50個(gè)結(jié)構(gòu)突變事件，表現(xiàn)出廣泛的非整倍性，提示在細(xì)胞周期或有絲分裂中存在缺陷。其KRAS和SMAD4的點(diǎn)突變率與其他亞型相似，TP53突變率略低于樣本的平均水平(61%比70%)。另外同其他亞型相比，該亞型的端粒的長度無明顯不同。(2)局部重排型(30%)。其在一條或兩條染色體上表現(xiàn)出明顯的局部結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為局部基因的擴(kuò)增或放大和復(fù)雜基因的重排。大約有1/3的局部重排型的基因組包含著原癌基因拷貝數(shù)目的增加如KRAS、SOX、GATA6的局部擴(kuò)增，有時(shí)會包括靶向基因如ERBB2、MET、CDK6、PIK3CA及PIK3R3，但發(fā)生率很低。剩余2/3的局部重排型存在著復(fù)雜的基因組事件，例如斷裂-融合-橋或染色體碎裂形成環(huán)狀染色體。(3)分散型(36%)。表現(xiàn)出中等程度的非隨機(jī)染色體損傷，以及<200個(gè)結(jié)構(gòu)改變事件。(4)不穩(wěn)定型(14%)。腫瘤表現(xiàn)出大量的染色體結(jié)構(gòu)改變事件(>200個(gè)，最多達(dá)558個(gè))，這體現(xiàn)了DNA維護(hù)的缺陷，提示這種亞型對DNA損傷藥物的敏感性較高。

二、以基因表達(dá)為基礎(chǔ)的分子分型

Collisson等[9]在2011年首次對PDAC進(jìn)行了分型。其通過對27個(gè)顯微切割的手術(shù)樣本進(jìn)行分析，將PDAC分為3種亞型：經(jīng)典型、類間充質(zhì)型、外分泌型。(1)經(jīng)典型：其黏附相關(guān)基因和上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)增高，且癌細(xì)胞內(nèi)GATA6及KRAS mRNA含量較高，預(yù)后較其他兩型好。(2)類間充質(zhì)型：間充質(zhì)相關(guān)基因(TWIST1、HK2、CAV1)表達(dá)增多，對吉西他濱更敏感，但預(yù)后最差。(3)外分泌型：通過免疫組織化學(xué)染色，可發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞來源的消化酶基因表達(dá)增高。但他們認(rèn)為外分泌型可能是被腫瘤周圍正常組織污染所致。隨后Janky等[10]通過對118例PDAC和13例正常胰腺組織標(biāo)本進(jìn)行分析表明，兩者間共有6 873個(gè)基因的表達(dá)存在差異，而其中有1 325個(gè)基因在PDAC中下調(diào)。其中肝細(xì)胞核因子1同源框A/B(hepatocyte nuclear factor 1 homeobox A/B，HNF1A/B)下調(diào)程度最強(qiáng)，其在分化較好的PDAC中表達(dá)較低，而在分化較差的PDAC中不表達(dá)。該研究同樣證明，經(jīng)典型的預(yù)后最好。但與Collisson等的結(jié)果不同的是，他們發(fā)現(xiàn)外分泌型和類間充質(zhì)型的預(yù)后相似。

Moffitt等[11]通過對145例原發(fā)性PDAC、61例轉(zhuǎn)移性PDAC、17個(gè)細(xì)胞系、46個(gè)胰腺和88個(gè)遠(yuǎn)端部位相鄰的正常樣本進(jìn)行基因芯片測序，對腫瘤的實(shí)質(zhì)和間質(zhì)分別進(jìn)行了分型：(1)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞分為經(jīng)典型和基底細(xì)胞樣型，并認(rèn)為這是獨(dú)立的預(yù)后因子。基底細(xì)胞樣型中層粘連蛋白和角蛋白基因表達(dá)增高，這與先前在膽囊癌[12-14]和乳腺癌[15]中描述的一致?；准?xì)胞樣型的預(yù)后較經(jīng)典型差，其中位生存時(shí)間短(11個(gè)月比19個(gè)月)，生存率低(44%比70%)。(2)間質(zhì)分為激活型間質(zhì)和正常型間質(zhì)。在正常型間質(zhì)中，胰腺星狀細(xì)胞的標(biāo)志物如平滑肌肌動蛋白、波形蛋白和結(jié)蛋白表達(dá)相對增高。激活型間質(zhì)的特征是存在一系列與巨噬細(xì)胞相關(guān)的基因如整合素ITGAM以及趨化因子配體CCL13/18的表達(dá)。激活型間質(zhì)中表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)展的相關(guān)基因，包括分泌蛋白SPARC、WNT家族成員WNT2和WNT5A、明膠酶B和間充質(zhì)溶解素3。由于成纖維細(xì)胞活化蛋白的出現(xiàn)已被證明與較差預(yù)后有關(guān)[16]，因此認(rèn)為激活型間質(zhì)的預(yù)后較正常型間質(zhì)較差。另外間質(zhì)和實(shí)質(zhì)的預(yù)后效應(yīng)是疊加性的，經(jīng)典型腫瘤+正常型間質(zhì)的危害性最低(HR=0.39)，而基底細(xì)胞樣型+激活型間質(zhì)的危害性最高(HR=2.28)。

Bailey等[17]以轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)差異為基礎(chǔ)將PDAC分為4種亞型，分別為鱗狀型、胰腺祖細(xì)胞型、免疫型和內(nèi)外分泌分化異常型(aberrantly-differentiated endocrine exocrine, ADEX)。(1)鱗狀型：TP53和KDM6A突變率較高，與炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、代謝重編程、TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MYC途徑激活、自噬和TP63delN及其靶基因的上調(diào)表達(dá)的基因相關(guān)。(2)胰腺祖細(xì)胞型：主要表達(dá)參與胰腺早期發(fā)育的基因(如PDX1、MNX1、HNF4G HNF4A、HNF1B、HNF1A、FOXA2、FOXA3和HES1)。特征是具有和內(nèi)胚層細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)的基因與無融合蛋白的共表達(dá)。(3)ADEX型：主要表達(dá)參與胰腺發(fā)育和分化的后期階段的基因(NR5A2、MIST1、RBPJL、INS、NEUROD1和MAFA)。(4)免疫型：其特征是存在與T和B細(xì)胞信號通路相關(guān)的免疫浸潤及Toll樣受體信號通路，預(yù)后極差。而Collisson分類中的類間充質(zhì)型、經(jīng)典型和外分泌型可分別被鱗狀型、胰腺祖細(xì)胞型和ADEX型所取代，其基因表達(dá)和臨床病理有著共同特征[11,16]。

最近癌癥基因組圖譜聯(lián)盟重現(xiàn)了二元經(jīng)典型、基底細(xì)胞樣型分類，并顯示ADEX亞型和免疫型是由于取材時(shí)樣本被瘤周正常組織污染所致。同時(shí)鱗狀型、類間充質(zhì)型、基底細(xì)胞樣型有著相同的特征；經(jīng)典型、胰腺祖細(xì)胞型有著相同的特征[18]。

三、以腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的特征為基礎(chǔ)的分子分型

腫瘤微環(huán)境對患者的預(yù)后有顯著的影響。Puleo等[19]對309例PDAC樣本進(jìn)行了基因表達(dá)、靶向DNA測序和免疫組織化學(xué)分析，根據(jù)腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的特征將其分為5種亞型。(1)完全經(jīng)典型：其間質(zhì)特征不明顯，細(xì)胞浸潤水平較低，KRAS突變和Gly12Arg較豐富。(2)免疫經(jīng)典型：間質(zhì)特征尤其是結(jié)構(gòu)血管化和免疫間質(zhì)較明顯，存在低蛋白酶體或凋亡信號，伴隨著NK、T、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤，且KRAS突變和Gly12Arg較豐富。(3)完全基底細(xì)胞樣：由基底樣細(xì)胞組成，間質(zhì)信號較低。Gly12Val是主要的突變類型，有MET和Hedgehog通路的激活，與轉(zhuǎn)移擴(kuò)散顯著相關(guān)。(4)間質(zhì)激活型：間質(zhì)中存在大量α平滑肌肌動蛋白，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、成纖維細(xì)胞活化蛋白等激活型間質(zhì)的成分。有MET和Hedgehog通路的激活，伴隨著大量的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞浸潤且其炎癥成分較多。(5)結(jié)締組織增生型：存在著低腫瘤成分和大量間質(zhì)轉(zhuǎn)錄組信號，包括免疫和炎性間質(zhì)組分特別是結(jié)構(gòu)和血管化間質(zhì)組分的高表達(dá)，伴隨著大量免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的浸潤。不同的是，間質(zhì)對預(yù)后的影響取決于腫瘤實(shí)質(zhì)的亞型。對于經(jīng)典型腫瘤來說，間質(zhì)對預(yù)后產(chǎn)生負(fù)性影響；而對于基底細(xì)胞樣型腫瘤來說則是正性影響。預(yù)后最差的是完全基底細(xì)胞樣型，其存活時(shí)間中位數(shù)為10.3個(gè)月；完全經(jīng)典型為43.1個(gè)月，免疫經(jīng)典型為37.4個(gè)月；間質(zhì)激活型的預(yù)后較完全基底型稍好。

四、以miRNA表達(dá)為基礎(chǔ)的分子分型

miRNA是一類非編碼的、17～25 bp的短RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[20-21]。其可以通過結(jié)合mRNA3`非編碼區(qū)導(dǎo)致基因的降解或抑制翻譯來控制基因表達(dá)水平[22-23]。其失調(diào)涉及到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，因此miRNA可以作為新型的診斷、預(yù)后和治療標(biāo)志物[24-27]。到目前為止，已有多種miRNA被證明和胰腺癌的預(yù)后相關(guān)。miR-142-5p和miR-320c可預(yù)測腫瘤對吉西他濱的反應(yīng)[28-29]。據(jù)報(bào)道，miR-200c、miR-142-5p和miR-204的高表達(dá)與切除后更好的存活率相關(guān)，而miR-155、miR-203、miR-210、miR-222、miR-21和miR-196a-2的高表達(dá)與切除后的不良預(yù)后相關(guān)[30-32]。Namkung等[33]通過對104例胰腺PDAC樣本進(jìn)行基因芯片分析得到了1 733種miRNA的表達(dá)圖譜。根據(jù)miRNA表達(dá)水平的不同，其將PDAC分為高風(fēng)險(xiǎn)、中等風(fēng)險(xiǎn)、低風(fēng)險(xiǎn)3種與預(yù)后相關(guān)的亞型。3種亞型的中位生存時(shí)間分別是17.2、26.5、32.4個(gè)月。又因?yàn)榈惋L(fēng)險(xiǎn)型和中等風(fēng)險(xiǎn)型的miRNA基因表達(dá)譜相似度較高，所以將其歸為一組，與高風(fēng)險(xiǎn)型相比較，其分類標(biāo)志為19個(gè)miRNA分子(miR-106b-star、miR-324-3p、miR-943、miR-1292、miR-4474-5p、miR-935、miR-668、miR-574-5p、miR-1244、miR-4763-5p、miR-145-star、miR-328、miR-26b-star、miR-615-5p、miR-1914-star、miR-564、miR-3194-5p、miR-4746-3p、miR-4321)。 在高風(fēng)險(xiǎn)組中，miR-574-5p、miR-1244和miR-4474-5p表達(dá)上調(diào)；而其他16個(gè)miRNA則下調(diào)。在效應(yīng)程度方面，miRNA-54-5p和miR3-243-3p的效應(yīng)最強(qiáng)。這19種miRNA中的6種(miR-574-5p、miR-1244、miR-145-star、miR-328、miR-26b-star和miR-4321)與總體生存率和無病生存率顯著相關(guān)[33]。

五、以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的分子分型

Wartenberg等[34]根據(jù)微環(huán)境的免疫細(xì)胞組成將PDAC分為3種亞型。(1)免疫逃逸型(54%)：其微環(huán)境中CD3、CD4、CD8型T細(xì)胞和CD20B細(xì)胞較少，但FOXP3+Treg細(xì)胞較多；存在局灶性p63表達(dá)且KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4及PIK3CA的突變率較高。形態(tài)學(xué)上腫瘤出芽程度較高，臨床病理特征不良。以上特征與預(yù)后較差(中位生存期10個(gè)月)相關(guān)。(2)免疫豐富型(35%)：在微環(huán)境中有大量的CD3、CD4、CD8型T細(xì)胞和CD20型B細(xì)胞，但FOXP3+Treg細(xì)胞少。其出芽程度較低，臨床病理特征較好。與免疫逃逸型相比，CDKN2A、SMAD4和PIK3CA突變率較低。在研究隊(duì)列中，很少有GNAS和IDH2突變。這些特征使其預(yù)后較好(中位生存期19個(gè)月)。(3)免疫枯竭型：有兩種亞群，而這兩種亞群在微環(huán)境特點(diǎn)上有很大相似點(diǎn)。第一種有PD-L1高表達(dá)，腫瘤出芽程度較高，PIK3CA突變率較大，伴隨著CD8/FOXP3比值高以及較差的預(yù)后(中位生存時(shí)間為10個(gè)月)；第二種為微衛(wèi)星不穩(wěn)定亞群，其DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失，有著最高的CD8/FOX3比值，高JAK3/PIK3CA突變率的抗腫瘤微環(huán)境，伴隨著透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運(yùn)動受體表達(dá)的腫瘤芽[34]。

目前胰腺癌的分子分型還沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，分型方法也不盡完善，某些亞型之間存在交叉重合性。應(yīng)綜合眾多分子分型方法的優(yōu)點(diǎn)，總結(jié)各種胰腺癌亞群的異同，朝著形成統(tǒng)一的分子分型方法的方向努力。相信隨著分子診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，會使胰腺癌的臨床分類診斷、個(gè)體化治療、反應(yīng)預(yù)測、預(yù)后評估達(dá)到新的高度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突