李 嬌，郭 靜，李 敏，孫黔云

(1.貴州醫(yī)科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014；2. 貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

內(nèi)皮細胞是位于血管腔內(nèi)表面的單層扁平上皮細胞，作為血液與組織液代替交換的關鍵接口，廣泛分布于全身大血管和各臟器官的微血管[1]。同時，內(nèi)皮細胞作為重要的代謝器官和內(nèi)分泌器官，起著調(diào)節(jié)血管功能的重要作用，與炎癥、心血管疾病、糖尿病等的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關系[2]。這一系列疾病的發(fā)生都與內(nèi)皮細胞的活化和損傷密切相關，在細胞的損傷因素中，補體是一個重要的損傷因素[3]。尤其是被過度激活的補體旁路，會導致內(nèi)皮細胞活化而產(chǎn)生一系列的炎癥反應，使細胞間黏附分子和炎癥介質(zhì)等表達上調(diào)，從而導致炎癥發(fā)生和組織損傷，引起一系列結構的改變和功能的失調(diào)[4-5]。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥民族藥傘形科植物川芎的主要活性成分，在臨床治療上被廣泛應用于心腦血管等疾病的治療[6]。相關研究表明，TMP能夠減輕內(nèi)皮細胞損傷，表現(xiàn)出修復細胞屏障、抗炎、抗氧化等功能[7-8]，提示TMP能抑制炎癥反應。但還沒有研究顯示TMP對補體旁路激活致人微血管內(nèi)皮細胞(human microvascular endothelial cell，HMEC)炎癥反應方面是否具有干預作用，目前也尚不清楚TMP在這方面的抗炎作用及其機制。因此，本研究以補體旁路激活誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生炎癥反應，探討TMP對補體旁路激活引起HMEC活化的干預作用及其相關的分子作用機制。

1 材料

1.1試劑HMEC細胞株為本課題研究組提供；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于杭州四季青生物工程有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；NF-κB信號通路質(zhì)粒、海腎熒光素酶報告質(zhì)粒和Dual-Luciferase reporter assy system，均為美國普洛麥格公司產(chǎn)品；感受態(tài)細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、Lipo6000TM脂質(zhì)體轉染試劑，購自于江蘇碧云天生物技術研究所；TMP標準品購自北京索萊寶科技有限公司，批號為1024A023；眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)由本實驗室分離純化制備和活力單位測定；人細胞間黏附分子1(intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管細胞間黏附分子1(vascular cell adhesion moleucle 1，VCAM-1)、E選擇素(E-selectin)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 檢測試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；正常人血清(normal human serum，NHS)由本實驗室制備；滅活人血清(inactivated normal human serum，INHS)是經(jīng)正常人血清56 ℃水浴滅活0.5 h制備而得。

1.2儀器ESCO CLM-170B-8-NF CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；NanoDrop 2000C超微量分光光度計(美國Thermo公司)；TS2-S-SM倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；連續(xù)波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)；DW-HL340超低溫冰箱(中國美菱公司)；GloMax 96化學發(fā)光檢測儀(美國Promega公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)HMEC的培養(yǎng)用FBS與RPMI 1640比例為1 ∶10的培養(yǎng)基，于37 ℃、含5% CO2飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2補體旁路激活物的制備將正常人血清與濃度為6.5×104U·L-1的CVF進行等體積混合后，于37 ℃水浴30 min制備CVF孵育產(chǎn)物(CVF-activated complement，CAC)[9-10]，同時以滅活正常人血清替代正常人血清，按照上述方法制備的孵育產(chǎn)物作為對照。

2.3CAC對HMEC黏附分子表達的影響把對數(shù)期生長的HMEC以1.0×104個/孔接種于細胞培養(yǎng)板，總體積100 μL，培養(yǎng)24 h后進行換液處理，即棄上清后用溫育的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗2次，加入40 μL CAC刺激產(chǎn)物后，再加入該培養(yǎng)基后補齊至100 μL，分別取0、2、6、10、24 h孵育上清，離心后按照ELISA試劑盒說明書測定ICAM-1、VCAM-1和E-selectin含量，復制前期研究模型。

2.4CAC對HMEC表達炎癥介質(zhì)的影響把對數(shù)期生長的HMEC以2.0×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，總體積200 μL，培養(yǎng)24 h后進行換液處理，即棄上清后用溫育的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗2次，加80 μL CAC孵育產(chǎn)物后，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基補齊至200 μL，分別取0、12、24、48 h細胞培養(yǎng)上清，離心后按照ELISA試劑盒說明書測定IL-6和TNF-α。

2.5TMP對CAC刺激HMEC表達黏附分子的干預作用把對數(shù)期生長的HMEC以1.0×104個/孔接種于細胞培養(yǎng)板，總體積100 μL，培養(yǎng)24 h后進行換液處理，即用溫育無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗2次后，加入50 μL該培養(yǎng)基和10 μL用生理鹽水稀釋的TMP(基于前期篩選，TMP終濃度分別為1.0×10-10、1.0×10-12、1.0×10-14mol·L-1)預處理細胞2 h，再加入40 μL CAC孵育產(chǎn)物，輕輕搖勻后孵育6 h，收集上清培養(yǎng)液，離心后按照ELISA試劑盒說明書測定ICAM-1、VCAM-1和E-selectin，以生理鹽水代替TMP，分別設置NHS CVF孵育產(chǎn)物模型組(Model)和INHS CVF孵育產(chǎn)物正常對照組(Control)。

2.6TMP對CAC刺激HMEC表達炎癥介質(zhì)的干預作用把對數(shù)期生長的HMEC以2.0×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，總體積200 μL，培養(yǎng)24 h后進行換液處理，即用溫育不含血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗2次后，加入100 μL該培養(yǎng)基和20 μL已稀釋的TMP，終濃度同“2.5”，預處理細胞2 h后，加入80 μL CAC孵育產(chǎn)物至200 μL，輕輕搖勻后孵育48 h，收集上清培養(yǎng)液，離心后按照ELISA試劑盒說明書測定IL-6和TNF-α含量，以生理鹽水代替TMP，分別設置NHS模型組和INHS正常對照組。

2.7NF-κB核轉錄活性檢測

2.7.1質(zhì)粒制備 分別將1 ng NF-κB表達質(zhì)粒和內(nèi)參重組質(zhì)粒加入到50 μL感受態(tài)細胞DH5α中，混勻后冰浴30 min，再經(jīng)42 ℃熱激90 s，再冰浴2 min，加入950 μL不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h，經(jīng)2 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清，用新鮮的LB培養(yǎng)基懸浮菌液后，取適量菌液均勻涂布于平板上(含有氨芐青霉素的LB固體篩選培養(yǎng)基)，于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取單菌落置于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，按碧云天質(zhì)粒小量抽提劑盒說明書，分別提取NF-κB表達質(zhì)粒和內(nèi)參重組質(zhì)粒，并用NanoDrop測定其濃度。

2.7.2雙螢光素報告基因檢測 將對數(shù)期生長的HMEC以1.0×104個/孔接種于96孔不透光細胞培養(yǎng)板，總體積100 μL，培養(yǎng)24 h后使進行轉染，轉染前，棄上清細胞培養(yǎng)液，用溫育無血清RPMI 1640培養(yǎng)基清洗2次后，加入90 μL含血清不含抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基，按脂質(zhì)體轉染試劑說明書進行轉染，然后每孔加入轉染混合液10 μL，轉染16 h后去除上清，各組參照“2.5”進行相應處理，其中TMP終濃度分別為1.0×10-10、1.0×10-12、1.0×10-14mol·L-1，加入CAC孵育產(chǎn)物4 h后進行螢光強度的檢測，以生理鹽水代替TMP分別設置NHS模型組(Model)和INHS正常對照組(Control)。按照下列公式計算各組相對核轉錄活性Ra，其中R1為各組的螢火蟲螢光素酶測定值，R2為各組海腎螢光素酶的測定值。

2.8統(tǒng)計學分析采用軟件SPSS 18.0進行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。

3 結果

3.1CAC對HMEC表達相關炎癥反應分子的影響CAC作用于內(nèi)皮細胞后導致ICAM- 1、VCAM-1和E-selectin 的表達上調(diào)，且在6 h時間點檢測到表達高峰，同樣，CAC作用于HMEC也導致炎癥因子IL-6和TNF-α的表達上調(diào)，并在48 h與對照組相比明顯上調(diào)(P<0.01)，與本課題組前期的實驗結果相同[10-12]。以上結果顯示本實驗成功復制CAC孵育產(chǎn)物誘導內(nèi)皮細胞炎癥反應模型。

3.2TMP對HMEC表達ICAM-1的影響Fig 1的結果顯示，3個濃度的TMP均可降低ICAM-1的表達，其中1.0×10-10mol·L-1的TMP抑制效果與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，結果呈現(xiàn)劑量依賴性。

Fig 1 Effect of TMP with different concentrations on ICAM-1expression of HMEC induced by CAC for 6

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.3TMP對HMEC表達VCAM-1的影響Fig 2結果表明，3個濃度的TMP預處理HMEC后，都能明顯降低VCAM-1的表達，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的量效關系。

Fig 2 Effect of TMP with different concentrations on VCAM-1expression of HMEC induced by CAC for 6

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.4TMP對HMEC表達E-selectin的影響如Fig 3所示，CAC導致HMEC表達E-selectin增加，而TMP能明顯抑制E-selectin的表達，其中1.0×10-10、1.0×10-12mol·L-1干預組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Fig 3 Effect of TMP with different concentrations on E-selectinexpression of HMEC induced by CAC for 6

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.5TMP對HMEC表達IL-6的影響Fig 4結果表明，HMEC經(jīng)TMP預處理后，其IL-6的表達明顯下調(diào)，其中，TMP(1.0×10-10、1.0×10-12mol·L-1)組與模型組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Fig 4 Effect of TMP with different concentrations on IL-6expression of HMEC induced by CAC for 48

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.6TMP對HMEC表達TNF-α的影響如Fig 5所示，TMP能下調(diào)HMEC中TNF-α水平， 其中，1.0×10-10mol·L-1組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 5 Effect of TMP with different concentrations on TNF-αexpression of HMEC induced by CAC for 48

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

3.7TMP對補體旁路激活致NF-κB轉錄活性的影響如Fig 6所示，CAC刺激HMEC后，NF-κB的核轉錄活性明顯上調(diào)，而TMP對CAC所導致的NF-κB核內(nèi)轉錄活性的增強有干預作用，其中，TMP(1.0×10-10、1.0×10-12mol·L-1)組與模型組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

4 討論

補體旁路的激活在機體天然防御系統(tǒng)中扮演著重要的角色，而在許多病理的機體中，該途徑的過度激活會導致機體炎癥反應和損傷，其中補體旁路激活誘導可致內(nèi)皮細胞炎癥反應，引起細胞形態(tài)改變、功能失調(diào)，引起細胞損傷，從而導致細胞內(nèi)相關指標的表達發(fā)生改變。眼鏡蛇毒因子CVF是一種來源于眼鏡蛇毒的高度特異的補體旁路激活蛋白，其在血清中可與B因子形成具有C3/C5轉化酶活性的CVFBb，從而激活補體旁路途徑，產(chǎn)生大量C3a、C5a及攻膜復合物(membrane attack complex，MAC)[13]。補體旁路激活產(chǎn)物刺激內(nèi)皮細胞后，會引起JAK2、NF-κB等炎癥相關通路活化，該激活方式與機體病理生理條件下的補體旁路途徑的過度激活高度一致，能反映體內(nèi)補體激活的真實狀況[9-10]，可作為一個特異的補體研究工具，用于模擬機體在病理狀態(tài)下補體旁路途徑的過度激活狀態(tài)。TMP作為貴州民族藥大品種川芎中提取的一種酰胺類生物堿，具有抑制機體過度炎癥反應，改善微循環(huán)、抗凝血、抗氧化等多種藥理活性[14]。近年來一些研究報道[15-16]，TMP對脂多糖和氧化低密度脂蛋白誘導的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，但對于補體旁路激活導致的內(nèi)皮細胞損傷和炎癥反應的保護研究均較少涉及。因此，本文采用CVF來激活補體旁路，探索了TMP對補體旁路激活誘導的HMEC炎癥反應的保護作用，以深入挖掘TMP的藥理藥效。

Fig 6 Effect of TMP with different concentrations on transcriptionalactivity of NF-κB after exposure of HMEC to

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

前期研究結果表明，加入CVF孵育產(chǎn)物刺激內(nèi)皮細胞后，內(nèi)皮細胞被激活，相關的信號通路活化，首先表現(xiàn)為NF-κB信號通路的活化，核內(nèi)轉錄活性上調(diào)，然后蛋白分子表達的變化，最后產(chǎn)生后續(xù)系列的炎癥反應[14]。在本研究中，內(nèi)皮細胞受到CAC 刺激后會引起ICAM- 1、VCAM-1、E-selectin、IL- 6和TNF-α的表達上調(diào)。其中前三者在6 h時達到峰值，IL-6和TNF-α的表達上調(diào)在48 h檢測點明顯高于對照。ICAM-1作為介導中性粒細胞和內(nèi)皮細胞黏附的黏附分子，在促進炎癥部位的黏連性中起著十分重要的作用；VCAM-1也是一種重要的黏附分子，在活化的內(nèi)皮細胞中高度表達；E-selectin也是一種重要的黏附分子，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用；而IL- 6和TNF-α則是重要的炎癥介質(zhì)。NF-κB信號通路在維持機體正常生理功能中起著很重要的作用，該通路的活化會介導炎癥反應。有研究表明，抑制NF-κB信號通路能夠取得較明顯的內(nèi)皮細胞保護作用[15]。NF- κB作為細胞內(nèi)核轉錄因子，起著調(diào)控上述分子靶基因轉錄的作用，與細胞炎癥反應生理和病理過程密切相關。這些黏附分子、炎癥介質(zhì)和NF- κB核轉錄因子在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色。其表達的上調(diào)提示CAC孵育產(chǎn)物刺激HMEC后，可直接導致基于微血管內(nèi)皮細胞活化應答的炎癥發(fā)生。

基于上述結果，檢測到TMP能夠抑制核轉錄活性的上調(diào)，抑制相關黏附分子和炎癥介質(zhì)的表達，結合目前已有的對炎癥相關信號通路的結果，認為其作用機制是與抑制核轉錄活性有關，至于具體作用的靶點還需要進一步的確認。文獻報道，TMP在干預氧化低密度脂蛋白對內(nèi)皮細胞的損傷模型中，也提示其作用機制與抑制NF-κB信號通路的活化有關[15]。基于TMP抑制了核內(nèi)轉錄活性，提示TMP抑制NF-κB信號通路的活化，從而下調(diào)與炎癥相關的細胞因子的轉錄調(diào)控表達，進一步抑制或減輕炎癥反應，表明TMP對補體旁路激活導致的HMEC炎癥反應具有一定的干預作用。

本研究結果表明，TMP對補體旁路激活致內(nèi)皮細胞黏附分子、炎癥介質(zhì)和NF-κB核內(nèi)轉錄活性表達上調(diào)均有不同水平的抑制作用，其中核內(nèi)轉錄活性的變化揭示其作用機制可能與NF-κB信號通路的活化有關。該工作有助于進一步闡明內(nèi)皮細胞炎癥反應相關信號通路調(diào)控機制和潛在的作用靶點，為深入挖掘TMP的開發(fā)應用價值提供參考依據(jù)和線索，同時，也為進一步開展貴州民族藥大品種中天然活性分子保護內(nèi)皮細胞損傷的機制研究提供新思路和新方法。

(致謝:本文實驗是在貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室藥理與活性篩選中心孫黔云研究員課題組的實驗室完成。)