■周建川 雷元培 王利通 鄭文革 趙麗紅* 計 成

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193；2.河南億萬中元生物技術(shù)有限公司，河南鄭州451191；3.浙江天蓬畜業(yè)有限公司，浙江衢州324111）

霉菌毒素是由真菌(霉菌)產(chǎn)生的具有毒性的次級代謝產(chǎn)物。霉菌毒素污染一直威脅著全球畜牧業(yè)和食品工業(yè)的發(fā)展。目前已知的霉菌毒素有數(shù)百種，其中對畜牧業(yè)威脅最大的有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素以及伏馬毒素等。玉米、小麥、稻谷等谷物作為人類食物和動物飼料的主要能量供給，現(xiàn)已深受霉菌毒素污染問題的困擾[1]。

目前關(guān)于霉菌毒素的檢測方法主要有：薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）等[2]，其中對HPLC法相對準確，其用免疫親和柱對經(jīng)過萃取的樣品進行凈化后，雜質(zhì)少，檢測限低。為了了解我國飼料原料及配合飼料受霉菌毒素污染的情況，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)國家重點實驗室與合作單位采用高效液相色譜法對國內(nèi)各個地區(qū)的1 034個飼料原料和配合飼料樣品中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素進行了檢測分析，為飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)提供參考。

1 材料與方法

高效液相色譜儀（SHIMADZU LC-20AT）；熒光檢測儀和紫外檢測儀（SHIMADZU RF-20A）；色譜柱為Agilent C18色譜柱，5 μm，4.6 mm×150 mm；色譜工作站（島津高效液相色譜LC工作站）；AFB1、ZEN和DON免疫親和柱，由德國Aokin公司生產(chǎn)。具體操作步驟參考德國Aokin公司霉菌毒素檢測的標準操作程序。AFB1、ZEN和DON標準溶液購自美國Supelco。

2 試驗方法

2.1 樣品采集

2017年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物營養(yǎng)國家重點實驗室與合作單位分別采集了遼寧、吉林、北京、天津、湖北、湖南、河北、河南、山東、安徽、浙江、江蘇、四川、福建、廣東、廣西等區(qū)域的玉米樣品324個、玉米副產(chǎn)物樣品90個、小麥及麩皮樣品150個、粕類樣品130個和全價料樣品340個，共計1 034個。采樣按照GB/T 14699.1—2005《飼料采樣》[3]的要求執(zhí)行，每份樣品不少于500 g。樣品粉碎后放置于-20℃冰箱中保存待測。

2.2 試樣的制備與提取

2.2.1 樣品前處理

稱取25 g磨碎的飼料原料或配合飼料樣品，置于250 ml錐形瓶中，加入100 ml體積比為6∶4的甲醇水提取液（注：根據(jù)不同霉菌毒素選擇不同的提取液），以高速攪拌提取3 min，靜置，過濾。樣品過濾液使用PBS緩沖液進行稀釋，使甲醇含量不得高于10%，如稀釋后樣品出現(xiàn)混濁，需再次過濾。

2.2.2 凈化

將免疫親和柱上方塞子取出并斜剪斷，再插回免疫親和柱上，上端接上10 ml玻璃注射器筒。摘掉親和柱下方堵頭，放出親和柱中的保護液。加入10 ml樣品濾液過柱凈化，調(diào)節(jié)流速為1 ml/min左右。

2.2.3 洗脫

過柱凈化液徹底排凈后，使用10 ml 10%的甲醇水洗脫2次，調(diào)節(jié)流速為3 ml/min左右。棄去流出液，最后分兩次各加入0.5 ml甲醇，分別孵育2 min，然后使用1 ml/min左右的流速將毒素洗脫出來，收集洗脫液進行上機檢測。

2.2.4 毒素的檢測

使用免疫親和柱-高相液相色譜法對樣品中的AFB1、ZEN和DON進行檢測。

黃曲霉毒素檢測方法參照GBT 30955—2014《飼料中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》[4]中的測定方法，并根據(jù)試驗情況進行適當調(diào)整。色譜檢測條件：流動相為甲醇∶水（45∶55）；流速為 1 ml/min；進樣量為 20 μl；柱溫35℃；外標法定量；熒光檢測，波長：λex=360 nm，λem=440 nm；出峰時間28 min。

玉米赤霉烯酮檢測方法參照GBT 28716—2012《飼料中玉米赤霉烯酮的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》[5]中的測定方法，并根據(jù)試驗情況進行適當調(diào)整。色譜檢測條件∶流動相為乙腈∶水∶甲醇（46∶46∶8）；流速為1 ml/min；進樣量為20 μl；柱溫35℃；外標法定量；熒光檢測，波長：λex=274 nm，λem=440 nm；出峰時間16 min。

嘔吐毒素檢測方法參照GBT 30956—2014《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》[6]中的測定方法，并根據(jù)試驗情況進行適當調(diào)整。色譜檢測條件：流動相為乙腈∶水（1∶9）；流速為1 ml/min；進樣量為20 μl；柱溫35 ℃；外標法定量；紫外檢測，波長：218 nm；出峰時間12 min。

3 結(jié)果與分析

按照飼料樣品中AFB1、ZEN和DON含量高于檢出限作為檢出，本研究中陽性樣品設(shè)定檢出限值如下：AFB10.5 μg/kg、ZEN 1 μg/kg和 DON 10 μg/kg。飼料和原料中AFB1、ZEN和DON允許限量參照我國于2018年5月1日即將實施的新《飼料衛(wèi)生標準》GB 13078—2017[7]執(zhí)行。

3.1 所有樣品總體情況

對1 034份飼料原料及配合飼料樣品共進行了3 102項次檢測，其中2 501項次檢測結(jié)果呈陽性，陽性率為80.63%。在1 034份樣品中，完全沒有檢測出霉菌毒素的樣品僅16份，占總樣品數(shù)的1.55%，僅檢出1種霉菌毒素污染的樣品僅136份，占總樣品量的13.15%；檢出2種霉菌毒素污染的樣品僅281份，占總樣品量的27.18%；檢出3種霉菌毒素污染的樣品有601份，占總樣品量的58.12%（見圖1）。

圖1 2017年飼料及飼料原料中霉菌毒素污染組成

3.2 2017年飼料原料及配合飼料中AFB1污染情況

表1為2017年飼料原料及配合飼料中AFB1檢測結(jié)果，樣品中霉菌毒素陽性平均值反映了毒素污染的嚴重程度，意味著引起危害的大小。從試驗結(jié)果可以看出，2017年玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、粕類和全價料中AFB1檢出率分別為84.57%、93.33%、57.33%、95.38%和100.00%，超標率分別為11.11%、17.78%、1.33%、27.69%和7.65%，其中粕類原料中AFB1超標率最高，達到27.69%。試驗結(jié)果顯示，2017年各種飼料和飼料原料中AFB1污染均比較普遍，其中粕類中AFB1污染最為普遍，小麥及麩皮中AFB1污染相對較輕。與周建川等(2017)[8]報道的2016年飼料和原料中AFB1污染趨勢相似。

表1 2017年飼料原料及配合飼料中AFB1檢測結(jié)果

3.3 2017年飼料原料及配合飼料中ZEN污染情況

從表2結(jié)果可知，本調(diào)查結(jié)果中各種飼料原料及配合飼料中ZEN的污染均普遍存在，玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮和全價料中檢出率均在80%以上，其中小麥及麩皮中ZEN檢出率最高，達到92.00%，粕類原料中ZEN檢出率最低，達到58.46%。玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、粕類和全價料中ZEN的超標率分別達到2.47%、28.89%、0.00%、6.15%和13.53%，其中玉米副產(chǎn)物中ZEN污染最為嚴重，超標率達到28.89%，主要以玉米皮和DDGS為主。然而，小麥及麩皮中ZEN檢出率最高，但是，ZEN污染的平均值較低，僅為23.91 μg/kg。因此，在玉米副產(chǎn)物的使用上需重點關(guān)注，避免玉米副產(chǎn)物中高濃度ZEN污染造成的經(jīng)濟損失。

表2 2017年飼料原料及配合飼料中ZEN檢測結(jié)果

3.4 2017年飼料原料及配合飼料中DON污染情況

嘔吐毒素是近年中國飼料原料及配合飼料中出現(xiàn)頻率最高的一種霉菌毒素，已逐漸成為我們關(guān)注的飼料和原料霉菌毒素污染的首要指標。表3結(jié)果顯示，玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、粕類及全價料中DON檢出率分別為96.30%、100.00%、89.33%、81.54%和100.00%，各種飼料原料和全價料中DON污染都非常普遍，其中2017年玉米副產(chǎn)物和全價料中DON檢出率高達100%。同時，超標率結(jié)果顯示，小麥及麩皮和玉米副產(chǎn)物中DON超標率最為嚴重，分別達到10.67%和6.67%，是DON污染的高風(fēng)險飼料原料，其DON最高值分別達到13 347.70 μg/kg和3 949.00 μg/kg。小麥及麩皮和玉米副產(chǎn)物作為飼料原料在全價料中使用時要重點關(guān)注。

表3 2017年飼料原料及配合飼料中DON檢測結(jié)果

4 討論

由本研究中抽檢的1 034個樣品的AFB1檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與王若軍（2003）[9]、張丞（2010）[10]以及周建川等（2017）[8]報道的蛋白飼料中霉菌毒素檢測結(jié)果相似，粕類原料中AFB1的污染最為嚴重。本研究中粕類原料AFB1陽性樣品檢出率高達95.38%，僅次于全價飼料樣品；粕類原料AFB1超標率高達27.69%，是幾種飼料原料中超標率最高的，其中花生極易受黃曲霉毒素污染[11-12]，黃曲霉毒素污染可發(fā)生在生產(chǎn)、儲藏、加工等各個環(huán)節(jié)，因此花生粕AFB1污染率較高在所難免。粕類原料中AFB1污染平均值為34.51 μg/kg，也與周建川等（2017）[8]報道的2016年粕類原料中AFB1污染平均值34.70 μg/kg接近。

飼料原料及配合飼料中ZEN檢測結(jié)果表明，在抽檢的玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、粕類及全價料中，玉米副產(chǎn)物中ZEN的檢出率和超標率仍然相對較高?？赡艿脑蚴怯衩赘碑a(chǎn)物（如玉米蛋白粉、玉米胚芽粕等）很容易受到霉菌毒素的嚴重污染[13]，且DDGS中特定霉菌毒素含量可以達到原谷物中含量的3倍左右[14]，這與周建川等（2017）[8]、王若軍（2003）[9]、張丞等（2010）[10]報道的結(jié)果相似。玉米副產(chǎn)物樣品中ZEN平均含量為485.46 μg/kg，超標率為28.89%。周建川等（2017）[8]和張丞（2008，2010）[10，15]也報道玉米副產(chǎn)物DDGS中ZEN含量嚴重超標。

嘔吐毒素抽樣調(diào)查結(jié)果表明，小麥及麩皮仍然是DON污染最嚴重的飼料原料，玉米副產(chǎn)物次之。玉米副產(chǎn)物和小麥及麩皮中DON超標率分別達到了6.67%和10.67%，DON的平均值分別達到了950.35 μg/kg和1 125.93 μg/kg。其中玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮中DON最高值分別達到了3 949.00 μg/kg和13 347.70 μg/kg，這與周建川等（2017）[8]和敖志剛等（2008）[16]報道的結(jié)果相似。

不同國家糧食、飼料和食品中的霉菌毒素限量標準不同。本試驗中霉菌毒素限量標準以2018年5月1日即將實施的新《飼料衛(wèi)生標準》GB13078—2017[7]中規(guī)定的允許限量為準，該標準于2017年10月14日發(fā)布。新的國家標準GB13078—2017[17]中各種霉菌毒素的允許限量都做了較大調(diào)整，特別是豬飼料中ZEN的允許限量。舊標準GB13078.2—2006[17]中規(guī)定玉米和配合飼料中ZEN的允許限量應(yīng)≤500 μg/kg，新標準GB13078—2017[7]規(guī)定仔豬配合飼料≤150 μg/kg、青年母豬配合飼料≤100 μg/kg、其他豬配合飼料≤250 μg/kg。對于飼料企業(yè)而言，新《飼料衛(wèi)生標準》對飼料原料和產(chǎn)品中霉菌毒素的控制要求更加細致嚴格。谷物在生長、收獲、儲存和加工過程中受地域、季節(jié)、氣候等各種非可控因素的影響，污染仍舊普遍，風(fēng)險依然存在；多種霉菌毒素并存現(xiàn)象，使霉菌毒素的限定標準和風(fēng)險管理變得更為復(fù)雜；且標準中飼料原料和產(chǎn)品中各霉菌毒素限量僅為基礎(chǔ)標準，優(yōu)秀企業(yè)的產(chǎn)品標準要求應(yīng)遠高于此。所以，我們應(yīng)高度重視霉菌毒素的潛在風(fēng)險，嚴格執(zhí)行飼料原料的品控標準，輔以良好的儲存條件，采用科學(xué)的解決方案和切實有效的產(chǎn)品，維護畜禽健康，提高生產(chǎn)性能。

5 結(jié)論

從以上結(jié)果中可以看出，2017年玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、粕類及全價料等飼料原料和配合飼料中霉菌毒素污染普遍存在。其中，玉米、玉米副產(chǎn)物DDGS和粕類中AFB1污染仍較嚴重，DDGS和玉米胚芽粕等玉米副產(chǎn)物中ZEN含量也較高，DDGS和小麥副產(chǎn)物中DON污染也相對嚴重，且不同飼料原料和飼料樣品中三種毒素的檢出率都比較高，應(yīng)注意霉菌毒素間的協(xié)同作用，因此，飼料及養(yǎng)殖業(yè)在使用飼料及原料時，一定要注意霉菌毒素的檢測，做好霉菌毒素的防控工作，并根據(jù)實際情況合理添加霉菌毒素生物降解劑，安全、高效的去除飼料及原料中的霉菌毒素，維護動物健康，提高經(jīng)濟效益。