余清文，羅小波，劉道宏*

1.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心骨科，北京 100091 2.解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是創(chuàng)面感染的常見(jiàn)細(xì)菌之一，常見(jiàn)于大面積燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷、糖尿病足、壓瘡或免疫功能低下的患者。最新研究數(shù)據(jù)顯示PA感染在感染創(chuàng)面中占比高，而且有逐年上升趨勢(shì)[1-2]。PA感染在創(chuàng)傷后8 h內(nèi)即可在創(chuàng)面形成生物膜，其引起的創(chuàng)面炎癥反應(yīng)強(qiáng)于金黃色葡萄球菌[3]，感染創(chuàng)面面積更大，病程更長(zhǎng)，致殘率、致死率更高，是阻礙慢性感染創(chuàng)面愈合的首要致病因素[4]。負(fù)壓創(chuàng)面療法(negative pressure wound therapy，NPWT)又被稱(chēng)為負(fù)壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)[5]或負(fù)壓輔助閉合(vacuum-assisted closure，VAC)[6]，是近20年來(lái)創(chuàng)面治療領(lǐng)域的最大創(chuàng)新。臨床應(yīng)用以來(lái)，在世界范圍內(nèi)對(duì)各種創(chuàng)面處理產(chǎn)生了重大影響，也被廣泛用于治療PA感染創(chuàng)面，目前已經(jīng)成為處理創(chuàng)面、控制感染、促進(jìn)愈合的重要手段之一。且對(duì)于NPWT控制PA感染的作用機(jī)制，目前也有了較深入的研究。本文敘述了近些年負(fù)壓封閉引流治療PA感染創(chuàng)面的最新研究成果，對(duì)其研究機(jī)制進(jìn)行匯總和分析，并探討了進(jìn)一步研究的方向。

1 細(xì)菌數(shù)量的變化

開(kāi)放創(chuàng)面常伴有細(xì)菌污染，創(chuàng)面感染的進(jìn)展與細(xì)菌數(shù)量相關(guān)，因此細(xì)菌數(shù)量一直是感染創(chuàng)面治療研究中的基本檢測(cè)指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者將NPWT應(yīng)用于各種感染性軟組織損傷的治療，取得了良好的效果[7-9]，但對(duì)于PA和其它不同菌屬清除效果不盡相同。Mou?s等[10]在臨床隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)：與傳統(tǒng)換藥相比，VAC能夠顯著促進(jìn)感染創(chuàng)面的縮小與修復(fù)，但細(xì)菌總量卻增加了，其中金葡菌顯著增加，而非發(fā)酵革蘭氏陰性菌減少。Sheppard等[11]對(duì)34例肢體開(kāi)放性戰(zhàn)創(chuàng)傷行VAC治療的患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：傷后每周從活組織培養(yǎng)細(xì)菌(>105CFU/g)的發(fā)生率為28%(第1周)，31%(第2周)和37%(第3周)，其中假單胞菌僅在第1周出現(xiàn)2例，占所有總數(shù)的3.7%，VAC確實(shí)能減少假單胞菌數(shù)量。

為了研究NPWT對(duì)PA的清除作用，學(xué)者們還做了深入的實(shí)驗(yàn)研究。Lalliss等[12]進(jìn)行了感染性軟組織損傷合并開(kāi)放性骨折的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示NPWT治療能夠顯著減少PA，而對(duì)金葡菌并無(wú)清除作用。VAN Hecke等[13]比較了普通非黏性敷料與聚乙烯醇和聚氨酯敷料結(jié)合NPWT對(duì)馬尸體腹部肌皮瓣創(chuàng)面體外的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行12 h處理之后，NPWT-聚乙烯醇敷料組的PA的細(xì)菌數(shù)量在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著低于其他組，NPWT組的PA細(xì)菌數(shù)量均低于無(wú)負(fù)壓治療的非粘性敷料組。

盡管臨床研究在研究對(duì)象、創(chuàng)面類(lèi)型、感染細(xì)菌的種類(lèi)、處理步驟和研究方法等方面都缺少一致性，但結(jié)果表明NPWT與細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)之間存在復(fù)雜的關(guān)系，表現(xiàn)出菌屬選擇性抑制的特點(diǎn)，能夠抑制包括PA在內(nèi)的非發(fā)酵革蘭陰性菌的增殖[14]。因此，最大限度控制干擾因素的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果更為可信，來(lái)自這些研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了NPWT能夠選擇性抑制假單胞菌屬的結(jié)論。在早期研究中，作者認(rèn)為NPWT增加創(chuàng)面血流量，改善了氧合作用，增強(qiáng)了受損組織對(duì)感染的抵抗力，進(jìn)而提高了細(xì)菌清除率；他們推測(cè)局部組織氧合作用的增加會(huì)減少厭氧菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的氧化爆發(fā)來(lái)而破壞細(xì)菌[6]。在使用消除了免疫系統(tǒng)影響的離體模型研究中，同樣觀察到PA數(shù)量的減少，說(shuō)明NPWT的物理作用能夠改變細(xì)菌生長(zhǎng)的微環(huán)境，從而抑制PA的增殖[13,15]。

2 對(duì)生物膜的作用

PA極易形成保護(hù)菌落聚集體的生物膜。成熟的生物膜不但幫助PA逃避免疫系統(tǒng)，還可阻止外源性抗菌物質(zhì)進(jìn)入，為細(xì)菌提供有利的繁殖環(huán)境，是慢性感染形成及難以治療的關(guān)鍵因素[16]。在PA導(dǎo)致持續(xù)慢性感染時(shí)，大量中性粒細(xì)胞的趨化集中，并非完全有利于PA的清除。相反，源于中性粒細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白和DNA所形成聚合物，利于PA早期生物膜的形成[17]。PA生物膜的存在會(huì)誘發(fā)持續(xù)低效的炎性反應(yīng)，阻礙組織修復(fù)并加重?fù)p傷，無(wú)法成功地進(jìn)入增生性階段及再上皮化或重塑階段，導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合[3]。

隨著研究的深入，學(xué)者們進(jìn)一步就NPWT對(duì)創(chuàng)面內(nèi)PA生物膜的作用進(jìn)行了探索。2012年，Ngo等[15]應(yīng)用體外模型觀察到NPWT能夠壓縮PA生物膜厚度，并縮短生物膜的擴(kuò)散距離。Phillips等[18]采用豬皮體外感染生物膜模型，發(fā)現(xiàn)間歇負(fù)壓引流結(jié)合不同消毒液沖洗，可以有效裂解PA生物膜的胞外聚合物基質(zhì)，殺傷生物膜內(nèi)的細(xì)菌。Tahir等[19]同樣采用體外模型研究消毒液或抗菌藥物溶液沖洗及聯(lián)合NPWT沖洗的效果，認(rèn)為單獨(dú)應(yīng)用NPWT能通過(guò)降低生物膜厚度和質(zhì)量來(lái)改變生物膜結(jié)構(gòu)，聯(lián)合聚維酮碘和聚六亞甲基雙胍抗菌溶液沖洗可以進(jìn)一步發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，減少生物膜活細(xì)菌的數(shù)量。還有學(xué)者研究了單獨(dú)應(yīng)用聚氨酯敷料或載銀微粒聚氨酯敷料，及與NPWT聯(lián)合應(yīng)用對(duì)體外生物膜細(xì)菌模型的作用，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有負(fù)壓作用的情況下，兩種敷料均不能顯著減少PA的數(shù)量，而NPWT結(jié)合載銀微粒聚氨酯敷料對(duì)生物膜細(xì)菌具有顯著的協(xié)同殺傷效應(yīng)，掃描電鏡證實(shí)僅有少量稀疏PA生物膜殘留，在3 d、5 d后均能完全滅活細(xì)菌[20]。

由于生物膜結(jié)構(gòu)特性和研究方法的局限，目前對(duì)于NPWT對(duì)PA生物膜作用的探索以體外實(shí)驗(yàn)研究為主。NPWT通過(guò)海綿敷料可以將體外負(fù)壓轉(zhuǎn)化為對(duì)創(chuàng)面正壓力，這一物理作用能夠壓縮生物膜結(jié)構(gòu)，反映在生物膜厚度和擴(kuò)散距離的降低[15]。而在間歇負(fù)壓循環(huán)模式下，海綿敷料網(wǎng)狀開(kāi)孔結(jié)構(gòu)產(chǎn)生宏觀形變和微形變的剪切力可以充分改變生物膜胞外聚合物的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，能增強(qiáng)殺菌消毒液和抗菌藥物對(duì)生物膜的滲透，進(jìn)而分離或滅活生物膜內(nèi)細(xì)菌，游離出來(lái)的細(xì)菌在隨后的負(fù)壓引流中被清除[18]。而NPWT與載銀敷料的協(xié)同殺菌效果也說(shuō)明，NPWT通過(guò)物理作用破壞生物膜結(jié)構(gòu)，是銀粒子能夠穿透生物膜殺傷細(xì)菌的基礎(chǔ)[20]。體外研究的數(shù)據(jù)可能基于缺乏臨床相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)室方法，在臨床使用時(shí)能否轉(zhuǎn)化為相同的療效或結(jié)果，需要通過(guò)深入進(jìn)行動(dòng)物模型或臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

3 細(xì)菌毒力的變化

PA分泌的各種毒素也是破壞創(chuàng)面組織和阻礙愈合的因素之一，其中外毒素A、鼠李糖脂和彈性蛋白酶是主要毒力因子。外毒素A是一種相對(duì)分子質(zhì)量66 000的酶，可以阻止細(xì)胞蛋白合成，導(dǎo)致組織壞死[21]。鼠李糖脂具有熱穩(wěn)定的細(xì)胞外溶血特性，可快速導(dǎo)致多形核細(xì)胞壞死，阻礙機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的清除作用[22]。彈性蛋白酶能導(dǎo)致組織損傷和炎癥，降解基質(zhì)蛋白、血漿蛋白及補(bǔ)體C3，還能抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)[23]，彈性蛋白酶既可以破壞軟組織、阻礙免疫清除作用，又可以抑制創(chuàng)面組織修復(fù)過(guò)程。此外，PA中還存在著群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)，其中結(jié)合3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯(3-O-C12-HSL)的Las系統(tǒng)和結(jié)合丁基高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)的Rhl系統(tǒng)都在皮膚和創(chuàng)面感染中發(fā)揮作用，可調(diào)控各種毒力因子的分泌[24]。

Wang等[25]在2016年首次報(bào)道了NPWT產(chǎn)生的體外負(fù)壓環(huán)境對(duì)PA毒力因子的影響，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常大氣壓下，負(fù)壓作用24 h后PA分泌的外毒素A，鼠李糖脂和彈性蛋白酶顯著減少；其毒力因子、Las和Rhl群體感應(yīng)系統(tǒng)的基因相對(duì)表達(dá)也明顯下調(diào)。之后他們又以兔耳軟組織損傷模型進(jìn)行了相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在NPWT治療6 d后，外毒素A、鼠李糖脂、彈性蛋白酶和生物膜毒力因子eDNA(extracellular DNA)均顯著減少，病理結(jié)果顯示NPWT治療后上皮和肉芽組織間隙顯著改善，同時(shí)新生上皮和肉芽組織明顯增加[26]。

普遍認(rèn)為PA是一種條件致病菌，自身的毒力及侵襲性相對(duì)較弱，因此NPWT治療對(duì)PA毒力影響的相關(guān)研究極少。NPWT的抽吸和引流作用可以排出來(lái)自創(chuàng)面、細(xì)菌和滲出物的毒素，這是創(chuàng)面內(nèi)細(xì)菌毒素減少的機(jī)制之一[27]。其次，毒力因子基因表達(dá)的下調(diào)也可導(dǎo)致毒力因子合成的減少。目前已有研究表明，抑制PA的QS系統(tǒng)可減少毒力因子的表達(dá)，控制感染[28]。抑制QS系統(tǒng)可能是其影響細(xì)菌增殖發(fā)育，降低毒力侵襲的作用途徑之一，但其內(nèi)在機(jī)制有待深入研究。

4 炎癥反應(yīng)的調(diào)控

臨床研究證實(shí)，負(fù)壓治療環(huán)境能夠影響炎癥反應(yīng)。Labler等[29]發(fā)現(xiàn)，在使用VAC治療軟組織開(kāi)放性創(chuàng)面的引流液中IL-8顯著升高，活組織病理中可見(jiàn)嗜中性粒細(xì)胞的聚集。Karam等[30]的研究亦表明，應(yīng)用NPWT可明顯減少創(chuàng)面引流液中TNF-α的含量。Eisenhardt等[31]發(fā)現(xiàn)，NPWT可顯著減少CD68+巨噬細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，并減少I(mǎi)L-1β和TNFα的表達(dá)。結(jié)果提示NPWT能夠通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用，抑制或降低炎性反應(yīng)的強(qiáng)度，降低持續(xù)炎癥帶來(lái)的自身?yè)p害，有利于感染控制與創(chuàng)面修復(fù)。

PA感染創(chuàng)面常表現(xiàn)為持續(xù)低效的炎性反應(yīng)，阻礙組織修復(fù)并加重?fù)p傷，甚至引起膿毒血癥[3]。Liu等[32]以小鼠燒傷感染PA敗血癥為模型，檢測(cè)了治療期間IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α的血清濃度，在治療3 d后，還對(duì)受傷的皮膚，肺，肝和腎組織進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示：與干濕紗布換藥相比，NPWT降低了細(xì)菌數(shù)量和血清內(nèi)炎癥因子濃度、避免了重要臟器的損傷，減少了膿毒血癥，降低了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。由此認(rèn)為NPWT通過(guò)限制細(xì)菌增殖和減輕敗血癥進(jìn)展來(lái)有效地降低炎癥程度。

Wang等[25]進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了創(chuàng)面局部IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)，以及創(chuàng)面不同深度層面的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)NPWT可以抑制創(chuàng)面局部炎性因子過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而降低創(chuàng)面炎癥反應(yīng)程度。這一現(xiàn)象的可能機(jī)制有：負(fù)壓的物理環(huán)境對(duì)創(chuàng)面細(xì)胞的生理活動(dòng)有所改變，從而對(duì)炎性因子的表達(dá)產(chǎn)生影響；NPWT可以將創(chuàng)面的分泌物以及非定植細(xì)菌及時(shí)引流至體外；炎性因子表達(dá)的減少，減弱了對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用，從而緩解感染狀態(tài)下的過(guò)度炎癥反應(yīng)。但目前，NPWT負(fù)壓環(huán)境對(duì)PA感染創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，以及免疫細(xì)胞功能狀態(tài)，尚未見(jiàn)深入的研究報(bào)道。

5 抗菌效果的改進(jìn)

隨著對(duì)負(fù)壓治療機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入和材料學(xué)的不斷發(fā)展，NPWT系統(tǒng)也在不斷改進(jìn)中。Ngo[15]發(fā)現(xiàn)NPWT結(jié)合載銀敷料，可在24 h內(nèi)迅速減少PA的數(shù)量。對(duì)比常規(guī)的NPWT，持續(xù)2周治療，也無(wú)法達(dá)到相同的療效；而單用載銀敷料，也無(wú)法達(dá)到結(jié)合NPWT的治療效果。Stinner等[33]采用羊腿復(fù)合創(chuàng)傷感染模型，也得到了同樣的結(jié)果，而且驗(yàn)證該治療方案對(duì)金黃色葡萄球菌也能產(chǎn)生顯著作用。

另一種改進(jìn)是NPWT結(jié)合消毒劑或抗生素治療。Moch[34]使用聚乙烯醇海綿作為藥物載體，對(duì)13例急性創(chuàng)面感染和14例慢性創(chuàng)面感染的患者進(jìn)行治療，取得較單純NPWT更好的療效。Rand等[35]使用了結(jié)合殼聚糖涂層的海綿敷料，作為抗生素的緩釋載體，結(jié)果顯著優(yōu)于采用單一的NPWT治療開(kāi)放性骨折污染模型。其他學(xué)者使用體外模型觀察NPWT聯(lián)合應(yīng)用不同類(lèi)型消毒劑如1%聚維酮碘溶液、0.1%聚六亞甲基雙胍、0.05%葡萄糖酸氯己定和抗生素如慶大霉素1 μg/mL、利福平24 μg/mL灌洗對(duì)成熟生物膜內(nèi)的PA的影響，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組能夠有效降低細(xì)菌數(shù)量，而單用消毒劑灌注沖洗組，對(duì)膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量基本改變[18-19]。

現(xiàn)有研究表明NPWT應(yīng)用載銀敷料對(duì)慢性創(chuàng)面中PA具有顯著殺傷作用，但在臨床應(yīng)用中還需要評(píng)估許多重要問(wèn)題，例如患者的年齡，創(chuàng)面的部位，以及是否會(huì)導(dǎo)致毒性的累積。對(duì)于聯(lián)合消毒劑或抗生素灌洗治療的研究，研究結(jié)果存在著較大差異，諸如不同研究采用不同的菌屬，不同的灌洗溶液，灌洗液在創(chuàng)面內(nèi)停留的時(shí)間不同。目前對(duì)組織修復(fù)的影響程度及負(fù)壓值調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)等也尚未形成統(tǒng)一觀點(diǎn)。

6 總結(jié)與展望

負(fù)壓創(chuàng)面療法(negative pressure wound therapy，NPWT)以其獨(dú)特的作用機(jī)理和不同于傳統(tǒng)治療的理念，已形成一套新的治療方案。NPWT控制感染的機(jī)制盡管尚不完全明確，但大量研究表明能夠有效減少PA的數(shù)量。同時(shí)，體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)支持NPWT能夠壓縮PA生物膜厚度和質(zhì)量來(lái)改變生物膜結(jié)構(gòu)，而間歇負(fù)壓模式能夠裂解其基質(zhì)結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)。對(duì)于PA在負(fù)壓作用下的毒力變化，僅有個(gè)別研究探索，卻為PA細(xì)菌毒力研究拓展了思路。PA感染的炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)歸直接影響到組織是否能夠修復(fù)再生，NPWT能夠抑制慢性炎癥反應(yīng)并無(wú)明顯爭(zhēng)議，其作用途徑值得深入探索。此外，對(duì)于NPWT聯(lián)合其他抗菌治療仍缺乏具體的臨床應(yīng)用性指導(dǎo)，包括如何選擇合適的敷料、灌洗溶液的類(lèi)型、最佳負(fù)壓的設(shè)置及更換間隔等。對(duì)NPWT治療銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面機(jī)制原理的深入研究和闡釋?zhuān)蛊湓谂R床上得到更科學(xué)有效的應(yīng)用，也為諸多基礎(chǔ)研究拓展了方向。