抗菌肽及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應用（一）

文/王玉堂

在治療動物的細菌性、病毒性等疾病過程中，因長期和大量使用抗生素，使得某些病原體對藥物產(chǎn)生了較強的耐藥性（抗藥性），而導致無法有效治療或控制疾病。研發(fā)新型抗生素的周期長（一般30年為一周期）、難度大、費用高，另一方面因水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度遠超過抗生素的研發(fā)速度，現(xiàn)有的抗生素開發(fā)策略多局限于既有的抗生素類別，難以有實質(zhì)性的突破，一種新的抗生素出現(xiàn)不久就會有病菌產(chǎn)生耐藥性?？垢腥拘蝿莸膰谰云惹行枰獙ふ页雠c現(xiàn)有的抗生素機理完全不同的新型抗菌物質(zhì)。而抗菌肽作為一種新型高效的抗菌藥物，由于其分子量小、水溶性好、抗菌譜廣、作用機制特別、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，成為新型抗生素開發(fā)的良好選擇。

抗菌肽的發(fā)現(xiàn)，尤其是抗菌肽對耐藥致病菌有良好的殺滅或抑制作用為治療相關(guān)疾病提供了一個新的途徑?？咕氖蔷珳实陌被崞?，是廣泛存在于細菌、植物、軟體動物、兩棲類動物、魚類、鳥類和哺乳動物體內(nèi)的一類小分子多肽，由20個～60個氨基酸殘基組成；由兩個氨基酸以肽鍵組成的肽稱為“二肽”，由多個氨基酸組成的肽則稱為“多肽”，因氨基酸組分和順序各不相同而組成不同的肽。通常10肽以下者較具醫(yī)藥及商業(yè)價值?？咕木哂谢钚詮?、功能廣泛、廣譜殺菌作用，在應用研究中有重要價值，這一新領域已引起越來越多研究者的關(guān)注。抗菌肽合成的速度非?？欤c以恒定速度合成的肽鍵相比，抗菌肽的生產(chǎn)比IgM快100多倍，因此稱抗菌肽是機體理想的第一道防線，目前已有多個魚類抗菌肽基因不僅被分離出來，還在活體內(nèi)對其進行了表達。

一、抗菌肽的來源、結(jié)構(gòu)與分類

抗菌肽最開始被定義為昆蟲體內(nèi)神經(jīng)誘導而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)。早在1972年，Boman等研究北美天蠶免疫投機時，發(fā)現(xiàn)惜古比天蠶（Hyalophoracecropia）在受外界條件刺激后，其免疫血淋巴細胞產(chǎn)生了一種具有抑菌作用的多肽物質(zhì)，該物質(zhì)隨后被命名為天蠶素（Cecropin）。此后，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物及至人體中分離到多種具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，至今已分離到2000多種。1986年，Lazarovici等從石紋豹鰨（Pardachirus marmoratus）的皮膚中分離到一種名為豹鰨毒素（Pardaxin）的抗菌肽，這是首次發(fā)現(xiàn)并報道的魚類抗菌肽，迄今為止已克隆和鑒定了150多種魚類抗菌肽。魚類抗菌肽與其它物種的抗菌肽相比殺菌作用更強，但同源性較低，種間差異大。

抗菌肽屬于小分子多肽，其結(jié)構(gòu)復雜多變。研究發(fā)現(xiàn)，不同抗菌肽在肽鏈長度、序列組成以及生化結(jié)構(gòu)上都有顯著差異，但通常具備兩個共同特點：一是抗菌肽屬于陽離子多肽；二是抗菌肽具有兩親性結(jié)構(gòu)（親水性和親油性），疏水性氨基酸殘基包括丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，親水性氨基酸至少含有2個帶正電荷的氨基酸殘基、精氨酸或賴氨酸，因為精氨酸和賴氨酸的存在通常帶有2個～7個凈正電荷，表現(xiàn)出較強的陽離子特征。翻譯后的修飾如二硫鍵的形成、C端酰胺化、N端形成焦谷氨酸以及較少的糖基化，有助于某些抗菌肽維持穩(wěn)定性和活性。此外，單個抗菌肽的多個亞型是由N-末端的改變而生成。一旦前肽產(chǎn)生，便可通過蛋白水解過程加工釋放具有生物活性的多肽，這種蛋白水解過程取決于分泌抗菌肽的組織或細胞類型。由于抗菌肽屬于具有兩親性的陽離子多肽，因此，它們的疏水性、正電荷網(wǎng)絡、柔性構(gòu)象以及二級結(jié)構(gòu)都相互影響著它們的生物功能。

按照來源，抗菌肽可分為動物、植物、昆蟲、真菌、細菌來源的抗菌肽。按照其功能可分為抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲和抗腫瘤抗菌肽。按照其結(jié)構(gòu)可分為線性α-螺旋肽（此類抗菌肽由于富含一些堿性氨基酸而帶正電荷，作用于細菌細胞膜時，可與細胞膜相互折疊，形成一個可以穿透細胞膜的疏水結(jié)構(gòu)，如天蠶素、蛙皮素等）、含有兩個或兩個以上以二硫鍵且具有β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽（如Hepcidin、Leap2、β-defensin等）、呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗菌短肽（如Cyclopsychotride）、散亂結(jié)構(gòu)的擴展肽（該類抗菌肽目前較為罕見，以Bacterianecin抗菌肽為代表）、由其它已知功能的多肽衍生的具有抗菌活性的肽類物質(zhì)五大類。目前報道的魚類抗菌肽在氨基酸序列上無較大的同源性，但是，其具有相似的結(jié)構(gòu)和共同的特征，如下載電荷、兩親性和疏水性等。

二、魚類抗菌肽的生化特點和組成

魚類抗菌肽是一類小分子蛋白質(zhì)，其組成和結(jié)構(gòu)復雜多樣，分子量大小和氨基酸組成各不相同，但它們根據(jù)一定特點所組成，如含有較多的半胱氨酸，形成較保守的α-螺旋結(jié)構(gòu)；含有較多的陽離子氨基酸如精氨酸或賴氨酸等而使分子帶正電荷。根據(jù)其生化和結(jié)構(gòu)特點，可將它們分成若干類型：

第一類：富含某種氨基酸的線性抗菌肽。此種類型的抗菌肽因富含一些堿性氨基酸而帶正電荷，與細菌細胞膜相互作用時可以折疊成有利于穿膜的疏水或雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，能選擇地作用于細菌外層細胞膜的某些部分，如帶陽離子的磷脂，增大其滲透性而殺死或抑制細菌的生長。這類分子還包括來源于虹鱒血清的salmocidin；八目鰻小腸的HFIAPs（hag fi sh intestinal antimicrobial peptides）；分離自泥鰍的misgurin；來源于雜交斑紋鱸皮膚、鰓和血液肥大細胞的piscidins以及分離自美洲擬鰈和豹鰨體有粘液的pleurocidins和pardaxins等，其中Brocal I，F(xiàn)alco A等人從刺泥鰈的皮膚粘液中分離出一種25氨基酸的線性抗菌肽pleurocidin（Ple），具有與其它許多抗菌肽類似的兩親性、α-螺旋結(jié)構(gòu)的鱸魚的皮膚和鰓可表達分泌的moronecidin抗菌肽。鱸魚moronecidin前體有79個氨基酸殘基，由信號肽、成熟肽和C片段3部分組成，氨基酸殘基數(shù)分別為22、22和35。經(jīng)圓二色譜分析其結(jié)構(gòu)呈α-螺旋。

第二類：含多個半胱氨酸分子內(nèi)形成環(huán)狀的抗菌肽類，這類抗菌肽由于含多個半胱氨酸而形成多個二硫鍵，從而使其二級結(jié)構(gòu)呈β折疊。這類分子包括來源于羅非魚的hepcidin和從克海七鰓鰻的皮膚上分離到富含半胱氨酸和精氨酸的多肽LCRP（lamprey corticostatin-related peptidi）等，其中hepcidin基因大概含有20個～25個氨基酸殘基，內(nèi)部有8個高度保守的半胱氨酸，形成4個分子內(nèi)二硫鍵，它有3個外顯子和2個內(nèi)含子，其中有1個長為273bp的ORF順序，編碼1個含有90多個氨基酸殘基的前多肽原；前多肽原包含3個區(qū)域，信號肽、成熟肽和由40個氨基酸殘基構(gòu)成的前hepcidin原。羅非魚hepcidin原類型目前報道的有3種，分別命名為TH1-5、TH2-2和TH2-3，前體肽分別有88、86和91個氨基酸殘基，相對分子量分別為9.5、9.4和9.8ku；三信號肽裂解位點分別位于第24～25、第22～23和第24～25密碼子上，在共同的保守區(qū)域，都含有8個半胱氨酸。羅非魚中的TH2-3和日本鰈魚的JF2相似，TH2-2和日本的JF1相似，TH1-5和鯛的hepcidin類似；通過晶體結(jié)構(gòu)模型表明，在半胱氨基酸部位都形成二硫鍵。從斑馬魚分離到的β-defensins有3種，分別命名為zfDB1、zfDB2和zfDB3。與哺乳動物β-defensins相同，三者的成熟肽都有6個半胱氨酸，形成3個二硫鍵，并形成的模式一致，即第1～5、第2～4和第3～6個半胱氨酸。結(jié)構(gòu)都呈β折疊，但zfDB1的N端有1個α-螺旋結(jié)構(gòu)。

第三類：組蛋白樣抗菌肽（histone-like proteins，HLPs）。這類肽在水生動物中僅發(fā)現(xiàn)于魚類中，蝦類、貝類中尚未見報道。如從鯰、斑紋鱸魚、銀大馬哈和鮭等的皮膚粘液、鰓、血液和肝臟中分離的parasin I、HLPs和SAM等，氨基酸序列和質(zhì)譜分析表明，它們與組蛋白H2A、H2B和H1非常相似。從大西洋鮭皮膚粘液中分離的SAMP H1（samonantimicrobial peptide H1）含有30個氨基酸殘基，中間富含Pro，N端乙?；?，但對其抗菌活性沒有影響；理論上的相對分子量為2836u。經(jīng)圓二色譜分析，其活性形式比非活性形式分子結(jié)構(gòu)上顯得緊湊和更具剛性。從鮒魚紅細胞上分離得到的一種特異蛋白H1與SAMP H1的氨基酸順序有78%的同源性，有3個信號肽切割位點，是鮒魚紅細胞上一種新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽。從鯰魚受傷皮膚粘液分離得到的parasin I是由H2A組蛋白經(jīng)酶cathepsin D在其N端Ser19-Arg20位置裂解作用后產(chǎn)生的一種抗菌肽。parasin I含有19個氨基酸殘基，具有廣譜抗菌活性。Jorge等從彩虹鮭魚皮膚分泌物中分離提取了1種新的抗菌肽Oncorhyncin Ⅱ，指出這種抗菌肽的前17氨基酸殘基與來自彩虹鮭魚組蛋白H1的前138～154個殘基相同，并測得其分子量為719513Da。從而指出這個Oncorhyncin Ⅱ抗菌肽是組蛋白H1的C末端69殘基的片段。從鱈體表粘液中分離得到的幾種抗菌肽活性因子，通過弱陽離子的交換色譜法和反相色譜層析技術(shù)，分離出來3種小肽，通過N端和C端氨基酸順序分析和質(zhì)譜分析，它們分別為核糖肽類L40（6397Da）、L36A（12340Da）、L35（14215Da）。

第四類：經(jīng)酰胺化、糖基化修飾的抗菌肽。這類肽由核糖體合成后，在高爾基體濃縮、加工時，在相關(guān)酶的作用下脫掉C端1個或多個氨基酸，或再與一些糖基結(jié)合而成有活性的成熟肽。這類肽在蝦類和一些海水魚類中比常見。如從健康的南美白對蝦血細胞和血漿中分離出了幾種抗菌活性因子，通過酶剪切、Edman降解、質(zhì)譜儀分析等方法以及從血細胞的cDNA庫中進行cDNA克隆，測定序列，發(fā)現(xiàn)南美白對蝦抗菌肽penaeidins具有其中一種肽的N端因形成焦谷氨酸而封閉；C端由于谷氨酸在成熟肽中被去掉而酰胺化等等。但由于它們的N一端富含脯氨酸。而C一端含有6個半胱氨酸組成的3個分子內(nèi)二硫鍵，使它們的結(jié)構(gòu)有別于其它類群的抗菌肽。還有從鯉體表粘液中分離出的27KD疏水蛋白和從丁鯛和鰻鱺皮膚粘液中分離出的分子量分別為65KD、49KD和45KD3種抗菌肽也是經(jīng)糖基化修飾的多肽。Jorge等從彩虹鮭魚的皮膚中分離出的一種新的具有抗菌功能的核糖肽類，測得其分子量大小為667616Da，并指出這種肽與40S的核糖體蛋白S30非常相似。Jorge等還從彩虹鮭魚的血細胞中分離出的具有抗菌特性的活性片段，研究得出這種活性片段對熱敏感，且能被蛋白酶所消化，從而推斷這一活性片段為一種類似蛋白質(zhì)的具有抗菌活性的天然成分。

三、魚類抗菌肽的基因結(jié)構(gòu)和功能

隨著研究的深入，一些抗菌肽基因被陸續(xù)克隆。2006年，劉碧蓮等根據(jù)GenBank中收錄的魚類抗菌肽hepcidin的DNA序列設計特定的引物，用RT-PCR法從鱖魚肝臟中克隆到hepcidin的cDNA，并構(gòu)建Pmd18-Thepcidin載體進行序列測定和分析，結(jié)果表明，該cDNA長為381bp，其中第20～277位核基因的開放閱讀框（ORF），編碼86個氨基酸，形成由信號肽（24個殘基）、前肽（42個殘基）和成熟肽（20個殘基）3部分序列組成的前體肽，與已報道的其它鱸形目魚類hepcidin相比，核苷酸序列的同源性為72.2%～92.0%，所推導的成熟肽與包括人類在內(nèi)的其他生物的hepcidin成熟肽的同源性在50%～86.4%。Park等經(jīng)質(zhì)譜和化學分析方法研究證實，8個保守的cys殘基形成4個鏈內(nèi)二硫鍵，分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4個鏈內(nèi)二硫鍵可使β-折疊結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。由Campagna S，Saint N等人2007年從條紋鱸的肥大細胞里分離出Piscidin抗菌肽，他們通過采用脂分子雙層的結(jié)構(gòu)分析和電生理實驗研究了這個包括22個氨基酸殘基的陽離子肽的抗菌機制，圓二色性實驗發(fā)現(xiàn)譜Piscidin在水中是無組織的，但卻有1個高度緊密的alpha-helix，8～17個氨基酸殘基在微胞環(huán)境中具有alpha-helix，由于有界限清楚的疏水和親水區(qū)域，這個分子有兩親性的特性。這種結(jié)構(gòu)和那些能使細菌細胞通透性增強的陽離子肽的結(jié)構(gòu)非常類似。Piscidin混合到偶氮植物凝血素二維的雙分子層多通道實驗發(fā)現(xiàn)，在不同的濃度下會出現(xiàn)1個Ⅰ-Ⅴ曲線，而且非常明確的表明肽分子能使細菌細胞膜通透。這個孔形成的活力通過單通道實驗進一步證實了。離子通道的特性更加明確的表明了Piscidin通過螺旋的孔道結(jié)構(gòu)更能使細菌透化，而不是通過“桶-桶板（barrel-stave）模型”。A.Falco等人從鮭科魚類的EST數(shù)據(jù)庫中調(diào)取了虹鱒β-防御素類抗菌肽的順序稱為c.mykiss βdefensin-1(omBD-1)，signal P3.0program分析發(fā)現(xiàn)，在omBD-1的19位后有1個假定的切割位點，切割位點后有1個含有41個氨基酸的前體肽和β-防御素共有的順序一樣，也有6個保守的cys殘基，它和從其它魚類中分離到的β-防御素類抗菌肽有85.7%的同源性，同人類有34.9%的同源性；omBD-1有1個正2價的陽離子，等電點為8，這有助于omBD-1與細菌細胞膜的結(jié)合。

近年來的研究重點，在于向建立水生動物免疫特異性cDNA文庫和表達序列標簽（ESTs）方面轉(zhuǎn)移，這將有助于發(fā)現(xiàn)更多的抗菌肽基因。Nam等地日本鰈魚類的cDNA和ESTs文庫，從中鑒定了許多免疫相關(guān)基因，如Mx蛋白基因、補體基因、干擾素調(diào)節(jié)基因等；從2種白對蝦的ESTs中發(fā)現(xiàn)了44個免疫功能相關(guān)基因，全部免疫ESTs中，屬于抗菌肽的ESTs數(shù)量占總數(shù)量的60%以上?？梢娍咕牡姆N類數(shù)目非常大，在水生動物中的分布也十分廣泛。