海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化Tau、α-Synuclein的意義

黃仕美

【摘 要】目的：觀察海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表達(dá)變化及相互關(guān)系，以探討神經(jīng)元內(nèi)易聚蛋白磷酸化Tau、α-Synuclein與海洛因致神經(jīng)元損傷的關(guān)系。方法：建立海洛因成癮大鼠模型，SD大鼠隨機(jī)分為短時(shí)組2w、長(zhǎng)時(shí)組4w及對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué)方法，顯示海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化Tau、α-Synuclein的表達(dá)變化。結(jié)果：海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)中磷酸化Tau、α-Synuclein的表達(dá)均較對(duì)照組顯著升高，長(zhǎng)時(shí)組高于短時(shí)組（P<0.05）。海洛因依賴組中磷酸化Tau與α-Synuclein的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.436，p<0.05）。結(jié)論：海洛因中毒可引起神經(jīng)元內(nèi)磷酸化Tau蛋白、α-Synuclein異常聚集。

【關(guān)鍵詞】海洛因;磷酸化Tau;α-Synuclein;海馬CA1

阿片類(lèi)毒品對(duì)人類(lèi)的危害被社會(huì)各界廣泛關(guān)注，海洛因依賴者比例有逐年升高的趨勢(shì)[1]。大量研究表明，海洛因依賴可導(dǎo)致廣泛神經(jīng)元變性壞死、萎縮退化及脫髓鞘改變，且海洛因依賴被認(rèn)為是一種與記憶、癡呆癥相關(guān)的慢性、復(fù)發(fā)性神經(jīng)變性疾病[2]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，海洛因依賴大鼠額葉、海馬區(qū)均出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元變性、嗜神經(jīng)現(xiàn)象等形態(tài)學(xué)改變。

大多數(shù)神經(jīng)變性疾病共同病理特征是神經(jīng)元內(nèi)存在易聚集蛋白，如Tau 蛋白、突變的α-突觸核蛋白（α-synuclein）、淀粉樣前體蛋白、Huntingtin蛋白等，它們對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡而出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀[3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于海洛因成癮及復(fù)吸所引起的神經(jīng)損害是否也與易聚集蛋白的毒性作用有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)研究海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化Tau蛋白、α-Synuclein表達(dá)水平的變化，探討海洛因依賴腦損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠30只，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。3月齡，體重200-220g，雌雄各半。

1.1.2 藥品和試劑

海洛因由貴州省公安廳提供。磷酸化Tau蛋白（Rabbit Anti-P-Tau protein）購(gòu)自北京博奧森;α-核突觸蛋白（α-Synuclein）購(gòu)自Santa公司;生物素化二抗（山羊抗兔IgG、鼠抗兔IgG）購(gòu)自北京博奧森公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型

經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重及性別隨機(jī)分為3組，每組10只，長(zhǎng)時(shí)組（皮下注射海洛因4w），短時(shí)組（皮下注射海洛因2w），正常對(duì)照組（皮下注射等量生理鹽水），飼養(yǎng)期分別為2周和4周，參照以往文獻(xiàn)成功復(fù)制海洛因依賴模型的方法，給予SD大鼠海洛因皮下注射，首日每次劑量3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量，連續(xù)9天（第9天每次劑量達(dá)27mg/kg）。對(duì)照組按同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育狀況及體重變化情況。第10天用5 .0 mg/kg納洛酮腹腔注射，誘發(fā)戒斷癥狀觀察30min，對(duì)海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進(jìn)行評(píng)分，確認(rèn)海洛因依賴模型成功。短時(shí)組繼續(xù)皮下注射27mg/kg海洛因4天（共計(jì)2周），每天2次;長(zhǎng)時(shí)組繼續(xù)皮下注射27mg/kg海洛因18天（共計(jì)4周），每天2次。生理鹽水對(duì)照組各5只大鼠分別采用與模型組相同劑量的生理鹽水注射2周、4周。

1.2.2 動(dòng)物行為變化觀察

觀察大鼠毛色、飲食、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)，用電子秤稱(chēng)量大鼠體重。參照Seebers等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行大鼠催促戒斷癥狀評(píng)分。

1.2.3 取材和標(biāo)本制備

各組大鼠分別用戊巴比妥腹腔注射麻醉，灌注4%的甲醛溶液固定，參照鼠腦立體定位圖譜冠狀取海馬CA1區(qū)腦組織（包含周邊組織）。

1.2.4 免疫組織化學(xué)Envision法

切片常規(guī)脫蠟至水，0.01mol/L枸緣酸鈉緩沖溶液（PH6.0）微波抗原修復(fù)，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，3%H2O2室溫避光孵育10分鐘，除去內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，胰酶（1：1稀釋?zhuān)?7℃恒溫箱中消化20min，使抗原位點(diǎn)暴露，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，分別滴加一抗磷酸化Tau蛋白、α--Synuclein （用PBS稀釋1：100、1：100），4℃冰箱孵育過(guò)夜，復(fù)溫，PBS沖洗3次，5min/次，磷酸化Tau蛋白滴加兔二抗IgG（PV6001），α--Synuclein滴加鼠二抗IgG（PV6002），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，5min/次，DAB液顯色，蘇木精輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.2.5 圖像分析

通過(guò)Biomias 2000 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算分析，具有陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域隨機(jī)選取4個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取陽(yáng)性表達(dá)部位進(jìn)行平均灰度值測(cè)定，平均灰度高則表達(dá)強(qiáng)，反之則弱。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（D）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的分析方法;相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析法。相關(guān)系數(shù)采用r表示，以P<0.05表示與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組相關(guān)蛋白表達(dá)比較（見(jiàn)表1）

異常磷酸化Tau蛋白陽(yáng)性表達(dá)存在于海馬神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突中，以軸突最為明顯;α-Synuclein蛋白主要集中在海馬神經(jīng)元核周胞質(zhì)及突觸終末;細(xì)胞外均未見(jiàn)表達(dá)。免疫組織化學(xué)定量分析，磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表達(dá)水平為：長(zhǎng)時(shí)組>短時(shí)組>對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)有顯著差異，P<0.05。

2.2 大鼠腦組織中磷酸化Tau蛋白與α-Synuclein的關(guān)系

海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化Tau水平與相應(yīng)時(shí)程用藥組的α-Synuclein蛋白水平呈正相關(guān)（0

3 討論

海洛因是成癮性極強(qiáng)的嗎啡衍生物，它由嗎啡經(jīng)乙?；瞥桑哂休^嗎啡更大的脂溶性，更易于通過(guò)血腦屏障以及對(duì)腦獎(jiǎng)賞性刺激。研究發(fā)現(xiàn)[4]，產(chǎn)生成癮和復(fù)吸行為的中樞主要在中腦邊緣系統(tǒng)。這個(gè)體系與動(dòng)機(jī)、獎(jiǎng)賞、心理強(qiáng)化等心理形成有關(guān)，中腦邊緣系統(tǒng)中的海馬、前額葉皮質(zhì)是空間學(xué)習(xí)記憶的核心中樞， 多年來(lái)已成為研究學(xué)習(xí)與記憶機(jī)制的重要解剖結(jié)構(gòu)。臨床和動(dòng)物試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)海洛因成癮可引起海馬缺氧缺血病理?yè)p害，而大鼠背側(cè)海馬CA1區(qū)對(duì)缺氧缺血更加敏感[5]。可見(jiàn)海馬CA1區(qū)是學(xué)習(xí)記憶的核心中樞，在以記憶、癡呆相關(guān)的神經(jīng)變性疾病（如AD、海洛因成癮等）中，易產(chǎn)生神經(jīng)元變性、缺失而出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，海洛因依賴成癮可致額葉、海馬區(qū)腦組織的泛素活化酶1（ubiquitin-activating enzyme 1，UbE1）表達(dá)量減少，且泛素化水平降低，推測(cè)泛素蛋白酶體系功能紊亂可能是海洛因?qū)Υ笫蟪砂a復(fù)吸或腦組織損害的原因之一。而泛素蛋白酶體系統(tǒng)具有識(shí)別磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白等多余的和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，以保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡的作用。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白表達(dá)變化及相互關(guān)系，探討易聚蛋白與海洛因致神經(jīng)元損傷的關(guān)系。

Tau蛋白是一種神經(jīng)元微管相關(guān)細(xì)胞骨架蛋白，正常情況下廣泛存在于神經(jīng)元內(nèi)，軸突含量很高。異常磷酸化可以引起Tau蛋白錯(cuò)誤折疊，形成配對(duì)螺旋樣二聚體（paired helical filaments，PHFs），是神經(jīng)原纖維纏結(jié)的主要成份，具有減弱順向軸漿運(yùn)輸?shù)茸饔?，?duì)神經(jīng)細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生不利的影響。以往研究還發(fā)現(xiàn)[2，5]，海洛因成癮復(fù)吸大鼠光鏡、電鏡觀察腦內(nèi)結(jié)構(gòu)見(jiàn)軸突、樹(shù)突中神經(jīng)微管和神經(jīng)微絲崩解。在軸突中，含量最高的微管相關(guān)蛋白是Tau蛋白，其功能由磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)，過(guò)度磷酸化的Tau蛋白喪失了促進(jìn)微管組裝的活性，使微管組裝降低，最終導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變。最具代表性的神經(jīng)元退行性變的疾病是人類(lèi)的阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，異常磷酸化Tau蛋白廣泛定位于大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突中，以軸突最為明顯，細(xì)胞外未見(jiàn)表達(dá)，異常磷酸化Tau蛋白陽(yáng)性表達(dá)在各組的表達(dá)水平為：長(zhǎng)時(shí)組>短時(shí)組>對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)有顯著差異，P<0.05。α-Synuclein蛋白是一種前突觸蛋白，主要在神經(jīng)組織中表達(dá)，是淀粉樣蛋白斑塊（NAC）的前體蛋白（NACP）。α-Synuclein蛋白異常聚集也可以引起神經(jīng)組織退化疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病、路易體癡呆等。研究還表明，Tau蛋白、微管蛋白、A-β肽等蛋白質(zhì)能促進(jìn)α-Synuclein蛋白的異常聚集[6]。因此，本次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了α-Synuclein蛋白表達(dá)，在海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)，α-Synuclein蛋白出現(xiàn)了與異常磷酸化Tau陽(yáng)性相似的陽(yáng)性表達(dá)，即：長(zhǎng)時(shí)組>短時(shí)組>對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)有顯著差異，P<0.05。

本研究結(jié)果顯示，海洛因依賴大鼠海馬CA1區(qū)的磷酸化Tau、α-Synuclein蛋白水平均顯著下降，且隨藥物依賴時(shí)間遞增，表明磷酸化Tau蛋白的異常聚集可能誘發(fā)了α-Synuclein蛋白的異常聚集。同時(shí)，二者蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者可能協(xié)同參與了海洛因成癮復(fù)吸或腦損傷機(jī)制，其異常聚集打破了泛素蛋白酶降解體系的調(diào)節(jié)平衡，使錯(cuò)誤折疊蛋白異常聚集，引起神經(jīng)元一系列退行性變，最終造成海洛因依賴腦組織受損和功能障礙。

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