張 旭,王小佳,黎思辰,董甜甜,汪志輝,2,*
(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院,四川 成都 611130; 2.四川農(nóng)業(yè)大學 果蔬研究所,四川 成都 611130)
柑橘果實易在成熟期和采后貯藏的過程中發(fā)生汁胞?;F(xiàn)象,表現(xiàn)為汁胞變硬,顏色變白,風味變淡,導致果實品質嚴重下降,甚至喪失商品價值。相關研究表明,在沙田柚、紅肉蜜柚和倫晚臍橙的?;杏^察到明顯的木質化現(xiàn)象,?;写嬖陲@著的木質素積累現(xiàn)象[1-2]。利用低場核磁成像對伏令夏橙?;M行研究發(fā)現(xiàn),隨著汁胞?;潭鹊募觿。Y合水數(shù)量增加,木質素含量與粒化程度呈顯著正相關[3]。木質素作為植物細胞壁的主要組成部分,與纖維素、半纖維素、果膠等物質交叉聯(lián)接。木質素的合成能夠對植物細胞起重要的保護作用,增強植物細胞抵抗病害和逆境的能力。但就園藝商品而言,木質素的積累會造成果實品質的下降,對園藝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展是不利的。木質素生物合成的研究已經(jīng)持續(xù)了很長時間,由于其合成途徑是一個非常復雜的過程,目前關于木質素生物合成的機理仍在不斷探索中。
木質素是由苯丙烷單體及其衍生物聚合形成的復雜酚類聚合物,依據(jù)不同的苯丙烷單體可將木質素分為由香豆醇合成的對-羥基苯基木質素(H)、由松伯醇合成的愈創(chuàng)木基木質素(G)、由芥子醇合成的紫丁香基木質素(S)三種類型[4]。不同的植物含有的木質素類型和組成比例不同,果樹上的研究發(fā)現(xiàn),碭山酥梨果實中主要以G、S型木質素為主,且G/S的比值會影響木質素的降解,從而決定果實中石細胞含量[5]?,g溪蜜柚?;邪l(fā)現(xiàn)木質素主要為G型木質素[6]。
近年來,隨著木質素生物合成途徑的不斷深入研究,對其合成途徑的調控網(wǎng)絡也在不斷地更新。如圖1所示,植物經(jīng)光合作用生成的同化物通過莽草酸途徑生成苯丙氨酸等芳香族氨基酸;苯丙氨酸通過苯丙烷途徑生成羥基肉桂酸及其輔酶A酯類化合物;羥基肉桂酸及其輔酶A酯類化合物通過木質素合成特異途徑生成木質素單體,木質素單體最終聚合形成木質素[7]。至今在莽草酸途徑中還未能準確找到木質素生物合成的調控靶點,但在苯丙烷代謝途徑和木質素合成特異途徑中發(fā)現(xiàn)了調控木質素合成的關鍵酶和相關轉錄因子[8]。因此,這兩個階段的研究成為了學者們的研究重點。近年來,利用生物技術手段,對參與這兩個階段的關鍵酶進行了克隆并通過轉基因試驗證實了這些關鍵酶在木質素生物合成過程中的作用。但這些酶是單一地參與木質素的生物合成,還是與上下游的關鍵酶形成調控網(wǎng)絡參與到木質素生物合成,目前還沒有形成明確的定論[9]。
2.1.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)
苯丙氨酸解氨酶由4個亞基組成,4個亞基分別由多基因家族編碼,包含多種同工酶,在植物生長發(fā)育、次生代謝以及抗逆方面起到極其重要的作用[11]。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸脫氨基生成反式肉桂酸,是苯丙烷代謝途徑的第一個關鍵限速酶[12]。目前對擬南芥中PAL基因的轉錄調控方面的研究較為深入[13],但由于基因表達還會受到轉錄后的泛素化調控和反饋調節(jié),導致轉基因植株中PAL蛋白不能穩(wěn)定表達。近年研究發(fā)現(xiàn),KFB家族作為PAL蛋白的負調控因子能有效地調節(jié)PAL的穩(wěn)定性和蛋白積累量[14]。迄今為止,在梨[15]、芒果[16]、杏[17]等多種果樹作物上已有PAL基因克隆以及序列分析等方面的報道,但大多研究主要探討不同誘導條件下PAL基因表達情況。從蜜柚汁胞中克隆得到的cmPAL基因只有一個成員[18],分析認為PAL基因表達具有組織特異性,表達強度隨組織和器官的不同而變化??傊琍AL基因的表達在轉錄和翻譯水平上都必然會受到多個調控因子的嚴格調控,這與植物內(nèi)部發(fā)育信號等條件有關,結合轉錄組測序以及蛋白互作等手段,能發(fā)現(xiàn)更多的調控因子,從而調控PAL基因的穩(wěn)定表達。
2.1.2 肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)
肉桂酸-4-羥基化酶催化肉桂酸C4羥基化形成對-羥基香豆酸,屬于植物細胞色素P450的cYP73亞族,是一種單氧化酶[19]。迄今為止,已有擬南芥、芒果、梨、柑橘等多種植物的C4H基因被分離出來,C4H基因所編碼的氨基酸序列同源性普遍較高,是木質素生物合成途徑中最保守的基因家族之一[20-22]。C4H轉錄豐度會影響植物中木質素、黃酮類化合物等的合成途徑,C4H能夠調節(jié)木質素單體G/S的比值,其位于PAL的下游且能夠調控木質素含量的變化,因此認為C4H是更為有效的限速酶[23]。在研究琯溪蜜柚時發(fā)現(xiàn),汁胞木質素積累量與C4H表達量在果實發(fā)育的不同時期都表現(xiàn)出同步增加的趨勢,后期果實cmC4H表達量增加,汁胞木質素含量增加[6]。但在奉節(jié)晚橙和奉節(jié)72-1臍橙化渣性研究中發(fā)現(xiàn),后期汁胞木質素含量差異不大,但C4H基因表達量卻不同,可能其參與其他次生代謝物的合成[24]。
2.1.3 香豆酸-3-羥基化酶(C3H)
香豆酸-3-羥基化酶是細胞色素P450單氧加酶家族的一員,主要催化甲酰肉桂酯類化合物。Franke等[25]通過圖位克隆方法證明擬南芥中的CYP98A3是C3H基因。香豆酸-3-羥基化酶是木質素合成過程中調控碳源輸送方向,決定木質素合成類型的關鍵限速酶。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn),柑橘汁胞?;^程中主要以G型木質素的合成為主[26],但目前關于調控C3H的活性進而對改變植物木質素含量的研究較少,因此,汁胞?;^程中C3H基因如何通過差異表達決定木質素合成的類型,還需要更深入的研究。
2.1.4 莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶(HCT)
莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶是決定木質素最終合成H-單體和G/S-單體的關鍵酶之一[27]。從石榴中克隆得到PgHCT,通過轉PgHCT基因的T2代擬南芥株系進行熒光定量分析,各組織中PgHCT基因表達量與木質素含量呈顯著正相關[28]。在琯溪蜜柚中克隆得到cmHCT,經(jīng)亞細胞定位發(fā)現(xiàn)cmHCT主要定位于質膜上,并結合HCT的表達特征,認為汁胞木質素的合成以G型木質素為主要途徑[18]。C3H和HCT處于木質素生物合成的上游,在木質素生物合成過程中有相似的功能。形成H-木質素和G/S-木質素單體關鍵取決于C3H和HCT的活性[29]。
2.1.5 4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)
4-香豆酸輔酶A連接酶是木質素合成途徑上游的一個關鍵酶,可將羥基肉桂酸催化生成相應的羥基肉桂酸CoA酯,進而參與后續(xù)的木質素、黃酮素類等的合成[30]。4CL通常以基因家族的形式存在于植物中,當植物遭受非生物脅迫等逆境時,不同亞型的4CL會參與不同的代謝。在枇杷木質化的過程中,初步確定Ej4CL1在枇杷果實木質素合成過程中發(fā)揮了重要作用,并采用煙草過量表達體系驗證了Ej4CL1基因功能,過量表達Ej4CL1能夠顯著增加煙草葉片木質素積累并減少單寧積累[31]。通過生物信息學分析,從克里曼丁柑橘基因組數(shù)據(jù)庫篩選鑒定出3個cit4CL基因,對其在北京檸檬不同組織和果實發(fā)育過程中的表達進行了分析,通過聚類分析將Cit4CL2和Cit4CL3基因聚到了主要參與木質素生物合成的ClassⅠ一類[32]。
2.2.1 肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)
肉桂酰輔酶A還原酶催化羥基肉桂酸CoA酯氧化還原為相應醛類物質,是決定木質素單體合成類型的關鍵酶之一。迄今為止,已有21種植物的CCR基因被克隆并進行研究分析[33-35]。植物中主要存在兩種類型的CCR,其中CCR1主要參與植物木質素的合成,而CCR2主要參與植物逆境生理[36]。進一步研究發(fā)現(xiàn),植物的不同組織中CCR基因存在組織差異性表達,但組織中木質素含量與CCR的表達量基本一致[37]。在研究授粉對琯溪蜜柚果心汁胞木質素合成影響時發(fā)現(xiàn),木質素含量的變化與果心汁胞CCR1表達量呈正相關,而CCR2的表達量與汁胞木質素含量呈負相關[6]。
2.2.2 阿魏酸-5-羥化酶(F5H)
阿魏酸-5-羥化酶是木質素生物合成中關鍵酶之一,對阿魏酸、松柏醛、松伯醇都具有催化作用,生成相應的5-羥基阿魏酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇,是S木質素單體合成的前提[38]。F5H是一種P450依賴的單加氧酶,通過生物信息學分析推測其是位于內(nèi)質網(wǎng)上的具有跨膜結構域的親水蛋白[39]。近年來,已從梨[40]、石榴[41]等果樹中克隆出了F5H基因。研究發(fā)現(xiàn),PbF5H是調控碭山酥梨果實S木質素合成的關鍵基因之一,影響木質素單體G/S比值,進而影響石細胞含量[40]。通過對桑樹F5H基因生物信息學分析發(fā)現(xiàn),F(xiàn)5H上游啟動子中無保守的AC元件,該基因表達不受MYB轉錄因子的調控,而是直接受NAC結構域的轉錄因子的調控[42]。
2.2.3 咖啡酸鄰位甲基轉化酶(COMT)
咖啡酸鄰位甲基轉化酶在木質素生物合成過程中主要參與甲基化反應,是決定木質素單體的類型以及組成比例的關鍵酶之一[43]。研究發(fā)現(xiàn),COMT是多基因家族,在木質素生物合成過程中,參與了多條甲基化反應[44]。COMT可以單獨或同時催化3′和5′位置的醛或醇,能夠分別將咖啡醛、咖啡醇轉化成松柏醛、松柏醇[45],將5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醛分別轉化成芥子醛和芥子醇[46]。研究發(fā)現(xiàn),在煙草和楊樹中抑制COMT基因的表達,S/G比值下降,且S型木質素含量顯著下降,G型木質素含量增加但變化不顯著[47]。但在琯溪蜜柚粒化汁胞中并未獲得COMT基因片段,根據(jù)前人研究柑橘中主要以G型木質素存在,因此推測?;锌赡蹸OMT表達量較少,甚至不表達,但具體原因尚無相關研究。
2.2.4 咖啡酰輔酶A-3-O-甲基轉移酶(CCoAOMT)
咖啡酰輔酶A-3-O-甲基轉移酶在木質素生物合成中主要催化羥基輔酶A酯的甲基化反應,將咖啡酰輔酶A轉化成阿魏酰輔酶A[48]??Х弱]o酶 A-3-O-甲基轉移酶是多基因家族,從現(xiàn)有的研究可以發(fā)現(xiàn),甲基化反應的關鍵酶在決定木質素單體結構和組成上有顯著效果,在轉基因苜蓿中,CCoAOMT被抑制造成G木質素下降50%,但對S木質素沒有影響[49]。研究者運用反義RNA等技術抑制擬南芥中CCoAOMT的活性,不但能降低木質素的含量,還能使其單元組成發(fā)生改變,從而降低G/S值[50]。由于其多以基因家族形式出現(xiàn),對于其研究有一定的困難。迄今為止,柑橘類CCoAOMT基因功能未見報道,但隨著基因編輯技術Cas9/gRNA的不斷完善,為進一步深入研究柑橘類CCoAOMT基因功能奠定了基礎。
2.2.5 肉桂醇脫氫酶(CAD)
肉桂醇脫氫酶主要將三種肉桂醛還原生成相應的3種肉桂醇(香豆醇、芥子醇、松柏醇)[51]。由于同工酶的存在,該酶在不同植物及相同植物不同組織中的催化功能有較大的差異。在擬南芥中分離出的AtCAD4和AtCAD5在高活性水平的條件下對G/S-木質素單體的合成有促進作用[52]。研究發(fā)現(xiàn),在煙草中同時下調CCR和CAD基因的表達,植株生長發(fā)育正常,但木質素含量顯著下降,推測兩者之間可能存在互作關系,但具體機制還要進一步研究[53]。紅肉臍橙在干旱/低溫脅迫下,CAD表達量上升,汁胞細胞壁合成大量的木質素[2]。在琯溪蜜柚中克隆得到2個CAD基因,序列差異不大,通過亞細胞定位,經(jīng)PSORT分析cmCAD1可能存在于內(nèi)質網(wǎng)上,推測與汁胞?;扒捌诩毎懈郀柣w增加相關,但需要進一步驗證該基因的功能[18]。
2.2.6 過氧化物酶(POD)
過氧化物酶是由單一肽鏈和卟啉構成的血紅素蛋白,擁有龐大的基因家族,廣泛存在于植物體內(nèi)的不同組織,參與活性氧代謝、木質素代謝等途徑[54]。POD作為木質素合成途徑的關鍵酶,經(jīng)過苯丙烷代謝合成的木質素單體,通過該酶催化作用發(fā)生脫氫聚合反應形成木質素[55]。按不同的催化底物POD可分為:谷胱甘肽POD(GSH-PX)、愈創(chuàng)木酚POD(PPOD)和抗壞血酸POD(APX)[56]。以往的研究主要集中在木質素與POD的關系上,如南豐蜜桔汁胞木質素含量、芥子醇含量、松伯醇含量與POD活性呈極顯著正相關[57]。研究發(fā)現(xiàn),碭山酥梨果實木質素代謝中主要以PPOD類型為主進而參與木質素單體的聚合,促進梨石細胞的形成[58]。柚汁胞中POD主要以可溶性和離子結合狀態(tài)存在,?;械腜OD為離子結合態(tài)的堿性POD,但POD參與?;举|素形成的分子機制還有待進一步的探索[59]。
2.2.7 漆酶(LAC)
漆酶屬于銅藍蛋白家族,含有500個左右的氨基酸,以氧氣為電子受體,具有豐富的催化底物。隨著研究的深入,漆酶已被證明對植物次生細胞壁的形成起到關鍵作用,是木質素單體最終聚合的關鍵酶[60]。近年來,相繼在棉花[61]、高粱[62]、水稻[63]中驗證了漆酶基因在木質素合成過程中起到關鍵作用。在柑橘上研究發(fā)現(xiàn),枳殼受到過量硼脅迫處理時,miR397可通過調節(jié)LAC7的活性促進木質素的合成,從而提高植株對硼毒害的耐受性[64]。通過生物信息學分析,甜橙基因組鑒定出24個漆酶基因(CsLAC1~CsLAC24),在大多數(shù)CsLAC中,有4個保守的特征序列和3個典型的特征序列,且觀察到Cu-氧化酶結構域。系統(tǒng)聚類分析表明,甜橙漆酶基因組CsLACs可分為7組,這表明其存在著不同的功能和作用,為進一步研究漆酶在柑橘中的功能提供了有價值的線索[65]。
在木質素生物合成過程中不僅需要多種酶基因的協(xié)調參與,同時也受到嚴格的轉錄調控。研究發(fā)現(xiàn),NAC轉錄因子和一些MYB轉錄因子在木質素合成中有重要調控作用[66]。如圖2所示,在擬南芥中,SND1及其同源蛋白NST1、NST2、VND6、VND7位于次生壁合成網(wǎng)絡的上游,MYB46、MYB83是它們的直接靶蛋白[67]。MYB46、MYB83作為直接靶蛋白受SND1及其同源蛋白 NST1、NST2、VND6、VND7的直接調控,MYB58、MYB63以及MYB85作為特異轉錄因子受MYB46、MYB83的調控,形成相應的轉錄網(wǎng)絡對木質素的合成進行調控[68]。后續(xù)通過某些MYB類轉錄因子與苯丙烷代謝途徑中與木質素合成相關基因上游啟動子的AC元件結合,對木質素生物合成進行調控[69]。在甜橙汁胞粒化的研究中分離并鑒定了CsMYB330和CsMYB308轉錄因子,發(fā)現(xiàn)基因的表達與木質素含量呈正相關,過表達該基因可以誘導木質素的積累,這表明了這兩種轉錄因子可能是柑橘汁胞木質素合成的轉錄因子[70]。進一步鑒定并分離了轉錄因子CsMYB85,發(fā)現(xiàn)在汁胞粒化過程中,CsMYB85表達水平顯著增加。CsMYB85結合CsMYB330啟動子,調控其表達,瞬時表達試驗表明,隨著CsMYB85的過量表達,汁胞中4CL1的表達量與木質素的含量變化趨勢一致,推測該轉錄因子通過調控4CL基因轉錄表達從而調控木質素的生物合成[71]。除NAC和MYB外,NtLIMl、ACBF和bHLH類轉錄因子也通過其他途徑參與調控木質素的生物合成[72]。
目前在柑橘?;^程中對木質素代謝研究存在的問題主要有:(1)更多的研究是針對木質素合成途徑中單個基因的功能研究,該基因表達量的上調和下調與木質素含量之間的關系仍有待進一步探討;(2)柑橘?;信c木質素合成相關基因的功能尚不能明確;(3)轉錄因子調控木質素生物合成,形成柑橘汁胞?;臋C制尚不明確;(4)現(xiàn)有的研究多以實驗室試驗為主,大田實驗進行較少,成果轉化率較低。結合當前研究存在的問題,今后對柑橘汁胞粒化過程中木質素生物合成的研究應集中在以下幾點:(1)利用轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等現(xiàn)代生物技術發(fā)掘更多與木質素合成的關鍵基因,確定關鍵基因之間的關系,基于多組學的網(wǎng)絡構建共同完善木質素生物合成調控網(wǎng)絡;(2)在柑橘粒化汁胞中克隆出相關調控木質素合成基因后,通過轉基因技術轉入模式植物中進行功能驗證,并進一步構建柑橘自身轉基因體系進行功能驗證;(3)結合目前已經(jīng)完成測序的甜橙基因組,利用RNA干擾技術發(fā)掘更多與木質素生物合成相關的轉錄因子;(4)廣泛收集柑橘種質資源,針對不同柑橘品種汁胞?;M行對比分析,結合大田試驗,探索能解決柑橘汁胞?;姆椒?,使研究成果有效轉化到實際生產(chǎn)之中。