方 蕾，費巧玲，侯 睿，高 源，韓宜芯，齊睿娟，蔡潤蘭，周 鴻，齊 云

（1.揚州大學醫(yī)學院藥學系，江蘇揚州 225009；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193；3.中國中醫(yī)科學研究院西苑醫(yī)院老年病中心，北京 100091）

Ⅰ型超敏反應是機體受到致敏原刺激后產(chǎn)生的一種由IgE介導的異常或病理性免疫反應，主要由致敏原結(jié)合于IgE致敏的肥大細胞形成抗原-IgEIgE Fc段受體I（FcεRI）交聯(lián)而引發(fā)，造成細胞脫顆粒并釋放組胺等過敏介質(zhì)，引起血管通透性增加和平滑肌收縮等速發(fā)型反應。目前抗過敏藥物的機制大多針對此環(huán)節(jié)，包括穩(wěn)定肥大細胞膜并阻止顆粒介質(zhì)釋放的藥物色甘酸鈉和酮替芬（ketotifen），以及組胺H1受體拮抗劑氯雷他定（loratadine）等。事實上，Ⅰ型超敏反應除組胺釋放等引起的早期速發(fā)相炎癥反應外，還發(fā)生遲發(fā)性炎癥反應，它通常是超敏反應反復發(fā)作和遷延不愈的主要病理基礎(chǔ)［1］。通常這一過程在致敏原刺激8～12 h后發(fā)生，激活的肥大細胞持續(xù)合成、分泌炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和前列腺素E2（prosta?glandin E2，PGE2）等，這些因子促進了白細胞向炎癥區(qū)域募集和持續(xù)性組織水腫。因此，抑制Ⅰ型超敏反應，不僅需要針對早期速發(fā)相炎癥反應，對后期的遲發(fā)相炎癥反應的控制也應給予相當?shù)闹匾暋?/p>

雙黃連（Shuanghuanglian，SHL）制劑是《中華人民共和國藥典》收錄的中藥復方，由黃芩、金銀花和連翹的提取物組成，臨床上作為抗微生物藥物，以多種給藥途徑用于治療細菌和病毒引起的上呼吸道感染和肺炎等。本課題組前期研究顯示，SHL注射液（SHL injection，SHLI）抑制脂多糖（lipopoly?saccharides，LPS）誘導的急性肺損傷與其抗炎和抗氧化作用密切相關(guān)［2-3］。

除常規(guī)適應證外，SHLI也用于治療Ⅰ型超敏反應性疾病，如支氣管哮喘［4］和濕疹［5］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)其具有較強的穩(wěn)定肥大細胞膜的作用，這一作用源于直接活化肥大細胞線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體，從而迅速降低胞質(zhì)鈣離子濃度［6］。結(jié)合本課題組前期發(fā)現(xiàn)的SHLI的抗炎作用，提示其機制可能是通過抑制P38和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化，從而減少LPS刺激的巨噬細胞TNF-α和IL-6等炎癥介質(zhì)的釋放［2-3］。由此推測，SHLI在Ⅰ型超敏反應中，不僅可針對速發(fā)相的脫顆粒反應，可能對遲發(fā)相時炎癥介質(zhì)的釋放也有作用。因此，本研究測定其體外對抗蝦原肌球蛋白（shrimp tropomyo?sin，ST）多抗血清誘導的大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞RBL-2H3脫顆粒和佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）/A23187刺激的人外周血嗜堿性白血病細胞KU812分泌炎癥介質(zhì)的作用，并觀察其體內(nèi)對ST和抗ST多抗血清誘導的小鼠Ⅰ型超敏反應足腫脹的影響，以探討SHLI對Ⅰ型超敏反應性炎癥的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、藥品、試劑和主要儀器

C57/BL6J小鼠，18～20 g，購自揚州大學實驗動物中心，許可證編號：SYXK（蘇）2017-0044。RBL-2H3細胞和KU812細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。SHLI（黑龍江多多藥業(yè)有限公司，13093013），酮替芬（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司），MEM和IMDM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，中國Excell Bio公司），4-甲基傘型酮-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷、PMA和 A23187（美國Sigma公司），人TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒（美國Biolegend公司），PGE2ELISA試劑盒（瑞士Enzo Life Science公司）。

熒光化學發(fā)光分析儀（美國Thermo Electron公司），Napco 5410型二氧化碳孵箱（美國NAPCO），XDS-1B倒置顯微鏡（重慶光電儀器公司），BCN-1360型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），Multiskan Ascent酶標儀（美國Thermo Electron公司），小鼠足容積測定儀（自制，精確度0.01 mL）。

1.2 小鼠抗ST多抗血清的制備

參照文獻［7］，提取刀額新對蝦ST，每只小鼠ip給予20 μg含鋁佐劑的ST，每周1次，連續(xù)6周。于6周末摘眼球取血，分離小鼠血清。

1.3 SHLI細胞毒性的測定

參照前期研究中SHLI的體外實驗濃度［2］，采用MTS法［8］檢測0.5%～2%SHLI對RBL-2H3細胞和KU812細胞24 h細胞毒性。2種細胞分別按每孔5×104和2.5×104細胞接種于96孔板，分別加入終濃度為 0.5%～2%的 SHLI，孵育 21 h。加入 20 μL MTS/PMS混合液后繼續(xù)孵育3 h。用酶標儀在波長492 nm處測定吸光度值（A492nm），計算細胞存活率，以選擇SHLI用于后續(xù)實驗的安全濃度。細胞存活率（%）=藥物組A492nm/細胞對照組A492nm×100%。

1.4 抗ST多抗血清和ST誘導的RBL-2H3細胞 β-氨基己糖苷酶（ β-hexosaminidase， β-HEX）釋放的測定

參照文獻［9］常規(guī)培養(yǎng)RBL-2H3細胞，待至對數(shù)生長期，胰酶消化后按每孔1×105細胞接種于48孔細胞培養(yǎng)板。貼壁后，除正常對照孔外，其余孔則分別加入抗ST多抗血清（終濃度2%），孵育過夜。次日棄上清，用Hank液洗細胞，加入陽性藥物酮替芬48 μmol·L-1（終濃度）或SHLI 0.5%～2%（終濃度），與細胞共孵育30 min。加入ST 20 μg·L-1（終濃度），37℃孵育1.5 h。取上清20 μL，加入反應底物4-甲基傘型酮-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷溶液（1 mmol·L-1）50 μL，25℃孵育 2 h，加甘氨酸終止液，在熒光化學發(fā)光分析儀λEX355 nm和λEM460 nm處測定熒光強度，以反映β-HEX相對釋放量。

1.5 PMA/A23187誘導的KU812細胞分泌TNF- α，IL-6和PGE2水平的測定［10］

KU812細胞以IMDM完全培養(yǎng)基（含10%FBS，青霉素100 kU·L-1，鏈霉素100 mg·L-1和L-谷氨酰胺 2 mmol·L-1）常規(guī)培養(yǎng)，待至對數(shù)生長期，按每孔1×106細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板。先用不同濃度的SHLI（終濃度0.5%，1.0%或2.0%）分別預處理細胞30 min，然后加入終濃度1 μmol·L-1的A23187和40 nmol·L-1的PMA；正常對照孔以完全培養(yǎng)基代替SHLI和PMA/A23187；模型孔只加PMA/A23187，不加SHLI。于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h取上清，采用ELISA法測定TNF-α和IL-6含量，24 h后測上清PGE2含量。

1.6 抗ST多抗血清和ST誘導的小鼠Ⅰ型超敏反應足腫脹時效關(guān)系測定

參照文獻［11］，采用毛細管放大測量法制備足容積測定儀，精確度0.01 mL。C57/BL6J小鼠10只，將抗ST多抗血清以生理鹽水1∶10稀釋，于小鼠右側(cè)足跖皮下注射血清30 μL進行致敏。24 h后，于激發(fā)前測定小鼠右側(cè)足跖容積（V），然后經(jīng)小鼠尾靜脈注射含ST 50 μg的生理鹽水，再分別于1，12，24和72 h測定足容積，觀察小鼠足容積隨時間的變化。以對側(cè)足為對照拍照。

1.7 動物分組、給藥和Ⅰ型超敏反應足腫脹模型的制備

C57/BL6J小鼠40只，隨機分為模型組、陽性藥物組（酮替芬 20 mg·kg-1）和 SHLI組（2.5和5.0 mL·kg-1），每組10只。小鼠給藥、模型誘導和測定時間點如圖1所示。第1天（D1）～D3，SHLI組小鼠ip給予SHLI，酮替芬組ip給予酮替芬，模型組則ip等體積生理鹽水，于抗原攻擊前連續(xù)給藥3 d。D2：在給藥1 h后，右側(cè)足跖皮下注射稀釋的抗ST多抗血清。D3：各組小鼠給藥處理同D1，并測定小鼠右側(cè)足跖容積V。給藥1 h后，每只小鼠尾靜脈注射含ST的生理鹽水，再分別于1和24 h后測右側(cè)足容積（V1h和V24h），并計算與V比較后的足容積差。

Fig.1 Schedule of treatment with Shuanghuanglian injection（SHLI）and passive cutaneous anaphylaxis in mice induced by shrimp tropomyosin（ST）.D1：the 1stday.

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Studentt檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SHLI對RBL-2H3和KU812細胞存活率的影響

如圖2所示，0.5%～2.0%SHLI組細胞存活率與RBL-2H3細胞和KU812細胞對照組比較無明顯差異，表明SHLI無明顯細胞毒性。

Fig.2 Effect of SHLI on cell viability of RBL-2H3 and KU812 cells.The cells were incubated with SHLI for 24 h and the cell viability was evaluated by MTS assay.Cell viability（%）=A492 nmof SHLI group/A492 nmof cell control group×100%.，n=3.

2.2 SHLI對抗ST多抗血清和ST誘導的RBL-2H3細胞 β-HEX釋放的影響

圖3所示，與細胞對照組比較，ST攻擊抗ST多抗血清誘導的RBL-2H3細胞發(fā)生脫顆粒，胞外β-HEX含量增加（P＜0.01）；與模型組比較，0.5%，1.0%和2.0%SHLI均明顯抑制ST攻擊致敏的RBL-2H3細胞β-HEX的釋放，熒光強度分別下降16%，31%和51%（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of SHLI on β-hexosaminidase（ β-HEX）release in RBL-2H3 cells induced by anti-ST-serum and ST.After being sensitized overnight with 2%anti-ST-serum，RBL-2H3 cells were pretreated with SHLI（0.5%，1.0%or 2.0%）for 30 min and then stimulated with ST（20 μg·L-1）.The β-HEX release was determined at 2 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

Fig.4 Effect of SHLI on production of tumor necrosis factor- α（TNF- α）（A），interleukin-6（IL-6）（B）and prostaglandin E2（PGE2）（C） in phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）/A23187-induced KU812 cells.KU812 cells were pretreated with SHLI for 30 min and then stimulated with A23187（1 μmol·L-1）plus PMA（40 nmol·L-1）for 6 h（TNF-α and IL-6）or 24 h（PGE2）.Cytokines in the cell supernatant were assayed by ELISA.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.3 SHLI對PMA/A23187誘導的KU812細胞分泌TNF- α，IL-6和PGE2的影響

如圖4所示，在PMA/A23187刺激的KU812模型中，細胞上清中TNF-α，IL-6和PGE2含量明顯升高（P＜0.01），而0.5%，1.0%和2.0%SHLI可抑制上述3種細胞因子的分泌，其中TNF-α分別降低35%，55%和69%（P＜0.01），IL-6分別降低29%，51%和74%（P＜0.01），PGE2分別降低31%，40%和54%（P＜0.01）。

2.4 抗ST多抗血清和ST誘導的小鼠Ⅰ型超敏反應足腫脹時效關(guān)系

如圖5所示，ST攻擊抗ST多抗血清致敏的小鼠足跖后1 h足容積和容積差顯著增加，12 h回落，24 h再繼續(xù)升高，呈現(xiàn)速發(fā)相1 h和遲發(fā)相24 h兩高峰。因此，本研究在后續(xù)藥物實驗中，選擇1 h作為速發(fā)相時間點，24 h作為遲發(fā)相時間點。

Fig.5 Paw swelling of mice induced by anti-ST-serum and ST.The 10%anti-ST-serum was subcutaneously injected into the mouse right paw and 50 μg ST was iv given to the mice 24 h later.The paw volume（A）and volume change（B）were measured at each time after ST challenge.x ± s，n=10. ＊＊P＜0.01，compared with corresponding group at 0 h.

2.5 SHLI對抗ST多抗血清和ST誘導的小鼠Ⅰ型超敏反應足腫脹的影響

如圖6A和B所示，尾靜脈注射ST激發(fā)1 h和24 h后，與左足比較，模型組右足可觀察到明顯的足部腫脹，SHLI給藥組足腫脹呈現(xiàn)不同程度的減輕。測定足容積發(fā)現(xiàn)（圖6C和D），SHLI組小鼠足容積和足容積差均顯著減小，速發(fā)相（抗原攻擊1 h）時2.5和5.0 mL·kg-1SHLI組足容積差分別降低69%和83%（P＜0.01），遲發(fā)相（抗原攻擊24 h）時則分別降低70%和100%（P＜0.05，P＜0.01），表明SHLI對抗ST多抗血清和ST誘導的小鼠Ⅰ型超敏反應速發(fā)相和遲發(fā)相足腫脹均具有明顯的抑制作用。

Fig.6 Effect of SHLI on paw swelling of mice induced by anti-ST-serum and ST 1 h and 24 h after ST chal?lenge.See Fig.1 and Fig.5 for the mouse treatment.SHLI and ketotifen was ip given for 3 d，respectively.A：paw swelling 1 h after ST challenge；B：paw sewelling 24 h after ST challenge；C：paw volume；D：paw volume change.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 ，compared with model group at the same time.

3 討論

臨床常見的Ⅰ型超敏反應性疾病如哮喘和食物過敏均涉及肥大細胞或嗜堿性粒細胞介導的炎癥反應。這些細胞在被抗原觸發(fā)產(chǎn)生由IgE介導的即時效應外，持續(xù)活化時分泌白三烯、TNF-α、PG和IL-6等炎癥介質(zhì)，具有促進嗜酸性粒細胞遷移浸潤、上調(diào)內(nèi)皮和上皮細胞黏附分子的表達、增加氣道反應性及促進單核細胞基質(zhì)金屬蛋白酶9釋放和成纖維細胞增生而參與組織重塑等作用［12］，對Ⅰ型超敏反應性疾病的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮重要作用。Ⅰ型超敏反應的速發(fā)相和遲發(fā)相，均因IgE介導肥大細胞活化所致。速發(fā)相歸咎于肥大細胞脫顆粒，而遲發(fā)相需要啟動相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯。從理論上講，采用IgE介導的RBL-2H3細胞模型既可測定早期的β-HEX，也可測定后期遲發(fā)相反應所分泌的TNF-α，IL-6及PGE2等因子。但實際上，抗原刺激IgE致敏的RBL-2H3細胞誘導的遲發(fā)相反應并不明顯。以鈣離子載體A23187和蛋白激酶C活化劑PMA協(xié)同活化KU812細胞，模擬的是遲發(fā)相的炎癥反應。本研究發(fā)現(xiàn)，SHLI除可以降低IgE介導的RBL-2H3細胞脫顆粒外，還抑制PMA/A23187誘導的KU812細胞分泌炎癥介質(zhì)PGE2，TNF-α和IL-6，提示SHLI不僅抑制Ⅰ型超敏反應速發(fā)相反應，對遲發(fā)相炎癥可能也有對抗作用。為此，本研究采用體內(nèi)模型對此作用予以確認。

目前，抗Ⅰ型超敏反應藥物評價通常采用的致敏動物血清誘導的被動皮膚過敏實驗（passive cuta?neous anaphylaxis，PCA）僅適用于速發(fā)相反應的測定。該法多采用抗卵清蛋白（ovalbumin，OVA）動物血清誘導PCA，將多抗血清皮內(nèi)注射于同種或異種動物的局部皮膚進行致敏，以伊文思藍為指示劑測定OVA激發(fā)1 h后局部皮膚藍斑直徑或萃取染料測定其吸光度［13］，然而該法并不能測定遲發(fā)相炎癥反應。另有研究者在皮膚超敏反應模型中對遲發(fā)相進行了測定，將2，4-二硝基苯酚IgE單克隆抗體經(jīng)尾靜脈注射于小鼠，24 h后在兩耳涂以2，4-二硝基氟苯，采用測厚儀測定小鼠雙耳的腫脹度，以1和24 h耳厚度分別作為衡量速發(fā)相和遲發(fā)相反應程度的指標［14］。但是由于小鼠耳部皮膚薄，對儀器的精密度要求高，而常規(guī)的測厚儀主觀性較強，誤差大（測定厚度的差值以μm為單位），并非一種適合常規(guī)實驗室開展的準確性和重復性好的測定方法。因此，本研究進行了方法學改進并建立了更適用于評價Ⅰ型超敏反應遲發(fā)相炎癥的體內(nèi)模型。

由于不同品系小鼠對抗原的敏感性有差異，常用的有C57/BL6J小鼠、BALB/c小鼠、129Sv小鼠和A/J小鼠等，其中C57/BL6J小鼠對牛奶、蝦和花生等抗原的敏感性較好［15］。因此，本研究選擇了該品系小鼠以誘導模型。根據(jù)PCA原理，采用致敏動物血清皮下注射于小鼠足跖部，24 h經(jīng)尾靜脈給予ST激發(fā)誘導足腫脹；然后采用經(jīng)典的急性炎癥模型（角叉菜膠致小鼠足腫脹）中毛細管放大測量法［11］測定小鼠足容積，以足容積變化的時效曲線來反映Ⅰ型超敏反應速發(fā)相和遲發(fā)相的炎癥。由于前期研究發(fā)現(xiàn)，ST 致敏性［9］和代表性［16］高于傳統(tǒng)抗原OVA，所以本研究用ST作為致敏原免疫小鼠［7］，獲得了富含IgE的小鼠血清，而且體內(nèi)實驗仍采用ST為抗原進行實驗。結(jié)果顯示，ST攻擊ST多抗血清致敏的小鼠足跖后1 h足容積增加，12 h時回落，24 h再繼續(xù)升高，呈現(xiàn)速發(fā)相1 h和遲發(fā)相24 h兩高峰，與劉繼勇等［14］測定皮膚超敏反應耳厚度的變化趨勢較一致。

本研究利用以上體內(nèi)模型觀察了SHLI對Ⅰ型超敏反應兩相反應的作用。結(jié)果顯示，在速發(fā)相（ST激發(fā)后1 h），SHLI可抑制抗ST多抗血清和ST誘導的小鼠足腫脹。陽性藥物酮替芬具有拮抗組胺H1受體和穩(wěn)定肥大細胞膜的作用，能夠明顯抑制Ⅰ型超敏反應速發(fā)相，本結(jié)果與此符合。對于遲發(fā)相（ST激發(fā)后24 h），SHLI亦可抑制小鼠Ⅰ型超敏反應遲發(fā)相足腫脹。據(jù)報道，酮替芬通過抑制趨化而減少超敏反應炎癥部位嗜酸性粒細胞的浸潤及其炎癥介質(zhì)釋放［17］，還可以降低OVA誘導的過敏性鼻炎小鼠血清中細胞因子TNF-α和IL-1β含量［18］，表明其還具有抑制超敏反應性炎癥的作用。本研究觀察到酮替芬對ST多抗血清誘導的小鼠遲發(fā)相足腫脹的抑制作用與此作用一致。綜上所述，SHLI具有抗Ⅰ型超敏反應全程的作用，不僅可抑制速發(fā)相脫顆粒，還可通過減少炎癥介質(zhì)的分泌來抑制遲發(fā)相炎癥反應。

值得關(guān)注的是，據(jù)臨床報道，SHLI有致速發(fā)型過敏反應的不良反應［19-20］，似乎與本研究SHLI抗過敏作用相矛盾。事實上，本課題組正是在研究SHLI致過敏的不良反應過程中發(fā)現(xiàn)其對肥大細胞脫顆粒具有良好的抑制作用［6，21］。藥物被機體作為異物識別而發(fā)生過敏反應與其可治療過敏性疾病二者之間并不矛盾。正如作為抗過敏的一線藥物酮替芬，其使用注意事項中也明確提出“對本品過敏癥禁用”。需要說明的是，SHLI通過線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體活化發(fā)揮其強大的肥大細胞穩(wěn)定作用［6］給其致過敏的研究帶來了困難。在研究設(shè)計SHLI致敏性實驗時，需要排除前者的干擾，這是研究過程中必須注意的。