高夢詩，鄭敏子，葉心怡，施國邦，闕祥潔，張隆超，孫漩嶸

（浙江工業(yè)大學長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310014）

含氮雜環(huán)化合物具有毒性低、內(nèi)吸附性高等優(yōu)點，因具有類似體內(nèi)生物堿（如嘌呤和嘧啶等）的結(jié)構(gòu)，對靶標具有高度的專一性，常被用做醫(yī)藥和農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)組成單元。現(xiàn)有研究表明，含氮雜環(huán)化合物在抗腫瘤［1-2］、消炎［3-4］、抗菌［5-6］、抗病毒［7］等方面表現(xiàn)出良好的生物活性。目前常采用不同的修飾基團對含氮雜環(huán)化合物進行修飾，以期發(fā)現(xiàn)可以作為候選藥物的先導化合物，促進新藥開發(fā)和研究。

二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類化合物（圖1）作為一類重要的含氮雜環(huán)化合物，可作為細胞周期檢查點激酶1（cell cycle checkpoint kinase 1，Chk1）抑制劑，具有潛在的抗腫瘤活性［8］。2016年，徐麗［9］將4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）催化合成得到的12個二氫吡喃并［2，3-c］吡唑衍生物對人乳腺癌細胞MCF-7進行了體外抗腫瘤實驗，結(jié)果表明具有一定的抑瘤作用。

Fig.1 Structural skeleton of dihydropyran ［2，3-c］pyrazole compound.

2016年，蘇為科教授課題組［10］通過多組分一鍋法制備得到多種新型二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類衍生物，本研究對其中第36號衍生物（后稱36號化合物，結(jié)構(gòu)式見圖2）的體外抑瘤作用和可能的作用機制進行探討，旨在為進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和體內(nèi)抗腫瘤活性研究等提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

36號化合物分子式為C23H22N4O，相對分子質(zhì)量370.45，熔點為149～151℃。以二甲亞砜（DMSO）制備36號化合物母液（100 g·L-1），4℃保存，臨用時用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

Fig.2 Molecular structure of No.36 dihydropyran［2，3-c］pyrazole derivative（No.36 Compound）

RPMI 1640培養(yǎng)基、0.5%胰酶細胞消化液、基因組RNA提取試劑盒（K0731）和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）購自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；胎牛血清購于浙江天杭生物技術(shù)股份有限公司；磷酸緩沖鹽溶液購于美國HyClone公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；青-鏈霉素溶液購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；SYBR Green qPCR Mix（2×）、AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒和JC-1線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

倒置生物顯微鏡TS100-F購自尼康株式會社，BB150 CO2培養(yǎng)箱和Veriti 96 PCR儀購自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司，TGL-20000cR高速臺式冷凍離心機購于上海安亭科學儀器廠，D3024高速微量離心機購自大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司，ACEA NovoCyte流式細胞儀購自艾森生物（杭州）有限公司，F(xiàn)lexStation多功能酶標檢測儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司，細胞培養(yǎng)板購于無錫耐思生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞Bcap-37和MCF-7及人肺癌細胞A549均由浙江省人民醫(yī)院隋梅花教授饋贈。用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，0.5%胰酶消化傳代。本實驗所用細胞均為對數(shù)生長期細胞。

1.3 MTT法檢測細胞存活

上述3種細胞以每孔1×104細胞分別接種于96孔板，將細胞分為正常對照組和給藥組，另設(shè)空白對照組（不含細胞），每組設(shè)3復孔，實驗重復3次。待細胞生長至＞50%融合度時，棄去培養(yǎng)基，分別加入含終濃度為0（正常對照組），1，5，12.5，25，50和100 mg·L-1的36號化合物培養(yǎng)液，孵育48 h，而后每孔加入MTT（5 g·L-1）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩至結(jié)晶完全溶解，酶標儀測定波長570 nm處的吸光度（A570nm）值。細胞存活率（%）=（給藥組A570nm-空白對照組A570nm）/（正常對照組A570nm-空白對照組A570nm）×100%。根據(jù)不同濃度36號化合物作用下的細胞存活率，用SPSS 22.0進行Probit回歸得其體外抑制各腫瘤細胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平

將Bcap-37細胞以每孔5×105細胞接種于6孔板，分為正常對照組和給藥組。分別加入終濃度為0和50 mg·L-1的36號化合物培養(yǎng)液，孵育48 h后，胰酶消化收集細胞。參照基因組RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，移取總RNA 1 μL并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)條件為：25℃，5 min；45℃，60 min；70℃，5 min。嚴格按照PCR儀Veriti 96說明書操作，并根據(jù)SYBR Green qPCR Mix（2×）說明書進行凋亡相關(guān)基因p21，p53，Bax和NF-κB的擴增，以β肌動蛋白作為內(nèi)參。設(shè)置PCR反應(yīng)程序，預(yù)變性：95℃，2 min；變性：95℃，15 s；退火/延伸：60℃，30 s；共40 個循環(huán)。熔解曲線分析：95℃，15 s。每一樣本同時設(shè)3復孔，輸出數(shù)據(jù)為復孔Ct值的平均值，待測基因mRNA相對表達水平用2-ΔΔCt表示。引物序列見表1。

Tab.1 Sequence of primers

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將Bcap-37細胞以每孔5×105細胞接種于6孔板，將細胞分為給藥組和正常對照組，每組設(shè)2復孔，實驗重復3次。根據(jù)MTT實驗所得IC50，分別加入含終濃度為0和25 mg·L-1的36號化合物的培養(yǎng)液，孵育36 h后，胰酶消化細胞。按細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒操作說明向細胞懸浮液中加入PI染色液，37℃避光溫育30 min，于流式細胞儀上檢測細胞周期，艾森NovoExpress流式軟件處理得細胞周期分布圖。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將Bcap-37細胞以每孔5×105細胞接種于6孔板，細胞分為正常對照組和給藥組，每組設(shè)2復孔，實驗重復3次。待細胞生長至＞80%融合度時，分別加入終濃度為0，25和50 mg·L-1的36號化合物培養(yǎng)液，孵育36 h后，胰酶消化細胞。按細胞凋亡檢測試劑盒操作說明向細胞懸浮液中加入AnnexinⅤ-FITC和PI染色液，室溫避光孵育20 min，于流式細胞儀上檢測細胞凋亡，艾森NovoExpress流式軟件處理得凋亡散點圖。

1.7 JC-1探針檢測線粒體膜電位

將Bcap-37細胞以每孔5×105細胞接種于6孔板中，細胞分為正常對照組和給藥組，另設(shè)陽性對照組〔細胞凋亡誘導劑羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP），10 μmol·L-1〕，每組設(shè)3 復孔。分別加入含終濃度0，10，25和75 mg·L-136號化合物的培養(yǎng)液，孵育24 h后，按照JC-1 MMP檢測試劑盒說明書操作。采用熒光酶標儀檢測相應(yīng)熒光通道的發(fā)射熒光強度值（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。檢測JC-1單體時，設(shè)置激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為538 nm（綠色熒光）；檢測JC-1聚合物時，設(shè)置激發(fā)波長為544 nm，發(fā)射波長為590 nm（紅色熒光）。以FI紅/FI綠比值反映線粒體膜電位的變化。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 36號化合物對Bcap-37，MCF-7和A549細胞存活率的影響

如圖3所示，36號化合物對Bcap-37，MCF-7和A549細胞存活均表現(xiàn)出抑制作用，且隨濃度的增加，抑制細胞存活的作用增強。作用48h，抑制3種腫瘤細胞存活的IC50分別為22.4±0.8，35.7±1.2和（30.1±2.9）mg·L-1。選取存活率受36號化合物影響最大的Bcap-37細胞作為后續(xù)實驗細胞，初步探索36號化合物可能的作用機制。

Fig.3 Effect of No.36 Compound on viability of Bcap-37，MCF-7 and A549 cells by MTT assay.Cells were treated with No.36 Compound 1，5，12.5，25，50 and 100 mg·L-1for 48 h，respectively.Cell viability（%）=（A570 nmof experimental group-A570 nmof blank group）/A570 nmof normal control group-A570 nm of blank group）×100%.±s，n=3.

2.2 36號化合物對Bcap-37細胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達水平的影響

RT-PCR結(jié)果（圖4）顯示，與正常對照組相比，36號化合物50 mg·L-1組Bcap-3細胞凋亡相關(guān)基因p21，p53，Bax和NF-κBmRNA相對表達水平均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of No.36 Compound on mRNA relative expression of apoptosis-related genes p21，p53，Bax and NF-κ B in Bcap-37 cells detected by RT-PCR.Bcap-37 cells were treated with No.36 Compound 50 mg·L-1for 36 h.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 36號化合物對Bcap-37細胞周期的影響

細胞周期檢測結(jié)果（圖5）表明，相對于正常對照組，36號化合物25 mg·L-1組細胞G1期比例顯著增加（P＜0.01），S期和G2期比例均有所下降。推測其可誘導Bcap-37細胞周期阻滯于G1期，抑制DNA合成，從而抑制細胞增殖。

Fig.5 Effect of No.36 Compound on cell cycle of Bcap-37 cells detected by flow cytometry.Bcap-37 were treated with No.36 Compound 25 mg·L-1for 36 h.B was the semi-quan?titative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 36號化合物對Bcap-37細胞凋亡的影響

圖6和表2結(jié)果顯示，與正常對照組相比，36號化合物25和50 mg·L-1處理細胞36 h后，各組細胞均出現(xiàn)明顯凋亡，且隨化合物濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡/壞死細胞比例顯著增加（P＜0.01）。

Fig.6 Effect of No.36 Compound on apoptosis of Bcap-37 cells by flow cytometry.Bcap-37 cells were treated with No.36 Compound 25 and 50 mg·L-1for 36 h.

Tab.2 Effect of No.36 Compound on apoptotic propor?tion of Bcap-37 cells

2.5 36號化合物對Bcap-37細胞線粒體膜電位的影響

如圖7所示，36號化合物10，25和75 mg·L-1處理細胞24 h后，隨濃度增加，F(xiàn)I紅/FI綠較正常對照組顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），提示 MMP 降低。與CCCP組相比，36號化合物75 mg·L-1組Bcap-37細胞MMP顯著降低（P＜0.05）。

Fig.7 Effect of No.36 Compound on mitochondrial membrane potential（MMP）of Bcap-37 cells by JC-1 fluorescent probe.Bcap-37 cells were treated with No.36 Compound 10，25 and 75 mg·L-1or carbonyl cyanide m-chloro?phenylhydrazone（CCCP）10 μmol·L-1for 24 h，respectively.FI：fluorescence intensity.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CCCP group.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新型二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類衍生物——36號化合物可抑制人乳腺癌細胞Bcap-37的體外增殖，表明其具有一定的細胞毒性。p53是人體內(nèi)最重要的抑癌基因之一，具有阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡等作用［11］。其產(chǎn)物P53蛋白能與特異性DNA序列結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，同時調(diào)控下游多個參與細胞周期和細胞凋亡的基因的表達［12］。Bax是Bcl-2基因家族中最主要的細胞凋亡促進基因之一，被認為是p53直接的早期應(yīng)答基因［13］。Bax蛋白可與Bcl-2形成異源二聚體，起到促進細胞凋亡的作用［14］。p21基因是p53最重要的下游基因之一，細胞受損時，P53激活p21基因表達，進而降低細胞周期蛋白E（cyclin E）-周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）復合物的活性，導致成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白（retinoblasto?ma protein，RB）磷酸化水平降低［15-17］，從而使細胞阻滯在G1期。RT-PCR結(jié)果證實，在36號化合物作用下，Bcap-37細胞中促凋亡基因p53，p21和BaxmRNA相對表達水平顯著增加。而NF-κB作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控機制多樣，在不同調(diào)節(jié)下可表現(xiàn)出抑癌或促癌作用［18-20］。研究表明，NF-κB，特別是其P65（RelA）亞基，在P53介導的凋亡信號通路中發(fā)揮著重要作用，NF-κB失活或活性降低可減弱P53誘導的凋亡［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，在36號化合物作用下，Bcap-37細胞中NF-κBmRNA相對表達水平增加，起到促進細胞凋亡和抑制腫瘤生長的作用。細胞周期和凋亡檢測結(jié)果進一步說明，36號化合物可阻滯Bcap-37細胞于G1期，抑制DNA合成，引起細胞早期凋亡。

Hengartner［22］認為，MMP 下降是早期凋亡的標志性事件，正常細胞中線粒體通透性轉(zhuǎn)變通道（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）存在周期性開放以維持細胞穩(wěn)態(tài)，而在凋亡階段，mPTP過度開放導致膜間隙的正離子不斷進入基質(zhì)，破壞原有的離子濃度梯度，使得膜電位下降或消失，嚴重影響呼吸鏈脫偶聯(lián)和ATP合成等正常生理活動，進一步促進凋亡誘導因子等的釋放。促凋亡基因Bax受到凋亡刺激后可從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體上［23］，引發(fā)細胞色素c的釋放，激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)［24-25］，引起細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度36號化合物使Bcap-37細胞膜電位顯著下降，且具有濃度依賴性；與凋亡誘導劑CCCP作用效果相比，膜電位下降明顯。推測在36號化合物刺激下，Bcap-37細胞mPTP過度開放，通過細胞內(nèi)線粒體途徑引起細胞凋亡，該結(jié)果與流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡得到的結(jié)果相吻合，即36號化合物可誘發(fā)Bcap-37細胞早期凋亡。

綜上所述，該新型二氫吡喃并［2，3-c］吡唑類衍生物對體外培養(yǎng)的Bcap-37細胞具有顯著的抑制作用，其引起的癌細胞早期凋亡可能由細胞內(nèi)線粒體通路和細胞外凋亡信號通路共同介導，具有潛在的抗腫瘤活性，可作為先導化合物進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，但該化合物的體內(nèi)抑瘤作用和具體作用靶點等還有待進一步研究。