延安產(chǎn)2種蒿類揮發(fā)油提取及抑菌活性分析

艾飛翔，周靖怡，馬 秋 ，張恩生，陳小莉，胡華林，李 ?，楊 華

（1.延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 延安 716000；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 510014）

植物源殺菌劑具有高效、低毒、無毒、易降解、選擇性高、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，近年來作為“環(huán)境和諧農(nóng)藥”受到人們的廣泛關(guān)注［1］。其中，植物揮發(fā)油殺菌劑占有重要比例［2-6］。青蒿（Artemisia carvifolia）和白蒿（Herba artimisiae sieversianae）均屬菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia）植物，為傳統(tǒng)中藥，已有研究報(bào)道了不同產(chǎn)地白蒿和青蒿的揮發(fā)油成分及抑菌活性。采用水蒸氣蒸餾法提取不同產(chǎn)地、不同季節(jié)的青蒿（A. carvifolia）揮發(fā)油，結(jié)果表明不同產(chǎn)地和不同季節(jié)的青蒿揮發(fā)油的主要成分及含量各不相同［7-11］；采用紙片法測定青蒿揮發(fā)油的抑菌活性，結(jié)果表明青蒿揮發(fā)油對大腸桿菌和茄鏈格孢菌具有顯著的抑制作用［11］；采用水蒸氣蒸餾法提取不同地方、不同季節(jié)的白蒿揮發(fā)油，結(jié)果表明，在白蒿揮發(fā)油中脂類、醇類、烷烴類化合物、萜烯類含量較多［12-16］；Zhimin等［13］發(fā)現(xiàn)白蒿揮發(fā)油對玉米象鼻蟲有熏蒸活性和接觸毒性，其 LC50和 LD50值分別為15.0、112.7 mg/L；呂敏蘭［16］報(bào)道了白蒿揮發(fā)油的抑菌效果會(huì)隨著生長期的不同而變化。

由此可見，不同產(chǎn)地、不同季節(jié)植物的化學(xué)成分及含量不同，導(dǎo)致植物提取物生物活性的改變。延安位于陜西省北部，屬黃土高原丘陵溝壑區(qū)，平均海拔1 200 m左右，屬于暖溫帶半濕潤易旱氣候區(qū)，特殊的地理氣候造就了延安產(chǎn)植物化學(xué)成分及活性有別于其他地方產(chǎn)的植物。鑒于延安產(chǎn)青蒿和白蒿從未被報(bào)道過，本研究擬通過水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)油，分析其化學(xué)成分，并對揮發(fā)油進(jìn)行抑菌活性測試，以期為該類植物累積實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：青蒿和白蒿，于7月份采摘于延安境內(nèi)。

供試真菌：腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、人參銹腐菌（Cylindrocarpon destructans）、菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、油菜菌核（Sclerotinia sclerotioru）、立枯絲菌核（Rhizoctonia solani）、梨黑星?。╒enturia nashicola）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、 根 腐 菌（Fusarium solani）、蒼術(shù)黑斑病菌（Alternaria tenuissima）菌種，均由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，4℃冷藏保存。

供試細(xì)菌：綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青枯菌（Ralstonia solanacearum），均由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，4℃冷藏保存。

試劑：蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制）、乙醚（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）。

儀器：N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，水蒸氣蒸餾裝置、中草藥粉碎機(jī)、日本島津QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取 將采集的青蒿和白蒿植物樣品陰干，粉碎，過孔徑900 μm篩，稱量500 g，置1 000 mL圓底燒瓶中，加水500～900 mL，浸泡12 h，連接好水蒸氣蒸餾裝置。用電熱套緩緩加熱圓底燒瓶至沸騰，并一直保持微沸狀態(tài)約5 h，直至無油狀物流出為止。用等體積的乙醚萃取餾出液3次，合并乙醚層，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾掉無水硫酸鈉，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醚，得到揮發(fā)油，密封4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GC-MS法確定揮發(fā)油成分 氣相色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱（ZB-5MSI，30 m × 0.25 μm × 250 μm）。用正己烷配制成150 mg/mL的2種植物精油溶液。程序升溫：初始溫度46℃保持 2 min，以4℃/min 升至206℃，再以 8℃/min升至310℃保持 3 min，然后青蒿和白蒿精油在310℃條件下分別運(yùn)行 44 min和46 min。柱子參數(shù)：汽化室溫度 250℃，接口溫度 280℃，進(jìn)樣量 1 μL，載氣為 99.999%高純氦氣，柱前壓 0.0528 MPa（7.65 psi），載氣流量 1.0 mL/min，分流比 20∶1，溶劑滯后時(shí)間 4.0 min。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源為 EI源，EI 源溫度230℃，發(fā)射電流 34.6 μA，四極桿溫度 150℃，倍增器電壓1 482V，質(zhì)量范圍 29～500 amu。

青蒿、白蒿揮發(fā)油用氣相色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫Nist 2005和Wiley 275，確定揮發(fā)油的化合物結(jié)構(gòu)，用峰面積歸一化法確定各化學(xué)成分的相對含量。

1.2.3 抑制真菌活性測定 將供試樣品用DMSO溶解，在無菌條件下用PDA培養(yǎng)基稀釋至2.0 mg/mL，使DMSO含量不超過5%，以1.1所示供試真菌為測試菌，利用抑制菌絲生長速率法［17］測試供試樣品抑制真菌的活性，以等量DMSO為對照，3次重復(fù)。放置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后用十字交叉法測定供試菌菌落生長直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率：

1.2.4 抑制細(xì)菌活性測定 采用96孔板微量稀釋法［18］：將2種精油用5%DMSO配成2.0 mg/mL的溶液，以含有1.1所示供試細(xì)菌的BPB培養(yǎng)基進(jìn)行2倍稀釋，以無菌培養(yǎng)液和5%DMSO溶液為空白對照，3次重復(fù)。微孔板震蕩混合后，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果，肉湯無渾濁的孔中的最低藥液質(zhì)量濃度為樣品對供試細(xì)菌的最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿和白蒿揮發(fā)油的抑制真菌活性分析

檢測了青蒿和白蒿精油對9種植物病原真菌的抑菌活性，結(jié)果（表1）表明，青蒿對所測植物病原真菌有一定的抑制作用，但抑制作用均較弱，對梨黑星病菌的抑制作用最強(qiáng)，也僅為68.00%。白蒿對真菌的抑制作用均較強(qiáng)，對供試的9種真菌的抑制率均達(dá)到65%以上，對梨黑星病作用最強(qiáng)、為98.11%，對人參銹腐菌、煙草赤星病菌的抑制率均達(dá)到90%以上，對立枯絲核菌抑制作用最差，也達(dá)到65.62%。

表1 青蒿和白蒿揮發(fā)油抑制真菌活性結(jié)果

2.2 青蒿和白蒿揮發(fā)油的抑制細(xì)菌活性分析

本研究檢測了青蒿和白蒿精油對5種供試細(xì)菌的抑菌活性，結(jié)果表明，兩種精油對綠膿桿菌（P. aeruginosa）、金黃葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、青枯菌（R.solanacearum）均沒有抑制作用，對大腸桿菌（E.coli）有一定的抑制作用，MIC均為500 mg/mL。

2.3 青蒿和白蒿揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析

青蒿揮發(fā)油總離子流圖譜見圖1，主要化學(xué)成分見表2。由表2可知，從延安產(chǎn)青蒿揮發(fā)油中共鑒定出26種化合物，其含量占總含量的67.95%，其中含量最高的為石竹烯氧化物（25.75%），其次為β-蛇床烯（8.31%），斯巴醇和1,1,6,6-四甲基二螺［2.1.2.1］辛烷含量分別為6.06%和6.01%，這幾種物質(zhì)的總量接近50%，是青蒿揮發(fā)油的主要化學(xué)成分。

白蒿揮發(fā)油總離子流圖譜見圖2，主要化學(xué)成分見表3。由表3可知，從延安產(chǎn)白蒿揮發(fā)油中共鑒定出49種化合物，占總含量的82.51%，其中含量最高的是萘嵌戊烷（30.37%），其次為匙葉桉油烯醇（12.04%），戊酸戊酯的含量為10.89%，茵陳炔酮的含量也達(dá)到7.88%，這幾種成分的總含量超過了60%，是白蒿揮發(fā)油的主要化學(xué)成分。

3 結(jié)論與討論

圖1 青蒿揮發(fā)油總流離子圖譜

圖2 白蒿揮發(fā)油總流離子圖譜

表2 青蒿揮發(fā)油主要化學(xué)成分

本研究分析了延安產(chǎn)青蒿和白蒿的揮發(fā)油化學(xué)成分及抑菌活性，結(jié)果表明延安產(chǎn)青蒿成分類型較其他地區(qū)略顯簡單，含量最多的成分為石竹烯氧化物（25.75%），β-蛇床烯（8.31%）、斯巴醇（6.06%）、1，1，6，6-四甲基二螺［2.1.2.1］辛烷（6.01%），與重慶等地產(chǎn)青蒿的主要化學(xué)成分有所不同［7-8，10，19］。其他地區(qū)產(chǎn)青蒿揮發(fā)油中蒿酮、桉葉素、樟腦、β-愈創(chuàng)木烯、1，3-二氧雜環(huán)戊烷、2-己烯醛、2，4-二甲基-2-戊烯等含量較多，而在延安產(chǎn)青蒿中的含量較少或沒有檢測出。劉芳［20］報(bào)道了采自遼寧白城的青蒿的揮發(fā)油對幾種植物病原真菌的抑制作用較為明顯。但本研究測試的延安產(chǎn)青蒿揮發(fā)油對9種供試植物病原真菌的抑制率不高，均在70%以下，可能是延安產(chǎn)青蒿揮發(fā)油中含有的抑菌活性成分較少。

表3 白蒿揮發(fā)油主要化學(xué)成分

延安產(chǎn)白蒿揮發(fā)油所含成分類型較其他地區(qū)復(fù)雜，主要成分為萘嵌戊烷（30.37%）、戊酸戊酯（10.89%）、匙葉桉油烯醇（12.04%）、茵陳炔酮（7.88%）。文獻(xiàn)［12-15，21-22］報(bào)道在哈薩克斯坦、哈爾濱、蘭州等地區(qū)所鑒定的白蒿揮發(fā)油中含量較多的為桉葉油素、丁酸香葉酯、龍腦、樟腦、月桂烯、1，8-桉葉醚、芳樟醇、2-乙烯基萘、亞油酸、棕櫚酸、巴豆酸乙烯酯等，而這些物質(zhì)在延安產(chǎn)白蒿揮發(fā)油中含量較少或者沒有檢測出。生物活性檢測表明，白蒿揮發(fā)油對9種供試真菌的抑制率較高，均在65%以上，其中對人參銹腐菌（C.destructans）、梨黑星?。╒. nashicola）、煙草赤星病菌（A. alternata）的抑制率較高，達(dá)到90%以上，然而對于細(xì)菌的抑制活性較低，對大腸桿菌（E. coli）的MIC值為500 mg/mL。結(jié)果表明，白蒿揮發(fā)油對于植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用，具有開發(fā)為農(nóng)用植物源抑菌劑的潛力。

綜上所述，延安產(chǎn)青蒿和白蒿揮發(fā)油與產(chǎn)自其他地區(qū)青蒿和白蒿的揮發(fā)油化學(xué)成分和活性均有所不同，這可能受延安特殊的地理地貌、年降雨量、土壤pH、陽光照射時(shí)間、空氣濕度等因素的影響，導(dǎo)致了延安產(chǎn)植物的化學(xué)成分及其含量與其他地方不同，不同的物質(zhì)基礎(chǔ)導(dǎo)致其活性也不同［23］。中草藥自古是陜北的三大寶之一，陜北的地理地貌和自然條件影響著某些植物次生代謝產(chǎn)物的累積，因此對陜北產(chǎn)藥用植物活性成分及活性的研究為陜北發(fā)展中藥材種植及開發(fā)利用具有重要意義。