白花蛇舌草ISSR反應體系的建立與優(yōu)化

高慧新， 嚴炯藝， 王明杰， 田 慧

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530200)

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.)為茜草科耳草屬植物，常于夏秋采集，洗凈，鮮用或曬干[1]。白花蛇舌草產(chǎn)于我國廣東、香港、廣西、海南、安徽、云南等省(區(qū))，多見于水田、田埂和濕潤的曠地，始載于《廣西中藥志》[2]。中醫(yī)認為其味苦、甘，具有清熱解毒、利尿消腫的功效，壯醫(yī)認為其味苦、甜，可用于通龍路、解熱毒、除濕毒、散結(jié)消腫[1]。白花蛇舌草的主要成分為有萜類、黃酮類、蒽醌類、甾醇類等，有抗癌、抗氧化和抗炎等作用，臨床上常用于治療多種癌癥[3]，且效果良好，是一味常用的中藥材。

隨著分子標記快速發(fā)展，越來越多的學者利用分子標記對物種遺傳分化進行研究。常見的分子標記有隨機引物擴增DNA多態(tài)性(random amplified polymorphism DNA，RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragrment length polymorhism，AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、簡單重復序列標記(simple sequence repeat，SSR)、簡單重復序列間標記技術(inter-simple sequence repeat，ISSR)等幾類。ISSR是由加拿大學者Zietkiewicz等于1994年在PCR的基礎上創(chuàng)建的分子標記技術[4]，其以微衛(wèi)星重復序列為引物，通常為16～18個堿基序列，由1～4個堿基組成的串聯(lián)重復序列和幾個非重復的錨定堿基組成，提高了PCR擴增反應的專一性。同時ISSR分子標記具有多態(tài)性高、重復高、穩(wěn)定性好、操作方便及成本低等優(yōu)點，被視為理想的遺傳標記方法[5]。

ISSR-PCR反應易受多種因素的影響，本試驗利用單因素結(jié)合正交設計的方法，旨在建立適合于白花蛇舌草ISSR-PCR反應的最佳體系，為白花蛇舌草種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 白花蛇舌草新鮮葉片采自廣西中醫(yī)藥大學仙葫校區(qū)，并由廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室主任田慧教授鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.)。

1.1.2 試劑與儀器 新型植物基因組DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker(D2000)、5×TBE均購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖(西班牙)；GelRed核酸染料(美國)；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。ISSR-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

Eppendorf移液槍(德國艾本德生命科學公司)，電子分析天平(BSA224S，北京賽多利斯科學儀器有限公司)，超純水機(MILIPORE ZMQS 5001，法國MILIPORE公司)，旋渦混合器(XW-80A，上海青浦滬西儀器廠)，高速冷凍離心機(SIGMA Sartorius，德國賽默飛世爾公司)，紫外分光光度計[UV1780島津企業(yè)管理(中國)有限公司]，梯度PCR儀(T100，美國Bio-Rad公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMXR+，美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 白花蛇舌草植物總DNA的提取 根據(jù)新型植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟對試驗材料進行植物總DNA的提取，并采用瓊脂糖電泳及紫外分光光度法檢測總DNA的純度及濃度，將其稀釋至40 ng/μL備用。

1.2.2 單因素條件考察 查閱相關文獻[5-7]，設定該試驗ISSR-PCR基本反應體系組成為總體積20 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，DNA模板量40 ng，dNTPs濃度0.225 mmol/L，引物濃度0.5 μmol/L，Mg2+濃度2.0 mmol/L，10×Taqbuffer 2.0 μL，其余用ddH2O補齊。擴增程序：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度由引物Tm值決定)，72 ℃延伸2 min，30個循壞；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。以初步篩選出的引物UBC826(ACACACACACACA CACC)作為單因素試驗及正交試驗的引物。對影響白花蛇舌草ISSR-PCR反應體系的5個因素：TaqDNA聚合酶用量、DNA模板量、dNTPs濃度、引物濃度、Mg2+濃度分別設置6個水平濃度梯度，采取控制單一因素變量的方法，初步確定該因素對 ISSR-PCR 的影響。各因素水平如表1所示。將PCR所得產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中，75 V電壓電泳50 min。使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并采集圖像。

表1 白花蛇舌草ISSR-PCR單因素試驗設計

1.2.3 正交試驗設計 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，確定各因素的正交試驗水平，見表2。采用L16(45)正交試驗設計，根據(jù)單因素試驗結(jié)果分別確定5個相關因素的4個水平，共16個處理組，見表3。其基礎反應體系和反應程序與單因素試驗所用體系和程序均一致。

表2 白花蛇舌草ISSR-PCR正交試驗水平

1.2.4 退火溫度的優(yōu)化 利用PCR，以UBC826引物的Tm值(52±5) ℃為范圍，由PCR儀自動生成8個溫度梯度：57.0、56.2、55.0、53.2、50.9、48.9、47.7、47.0 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法檢測，本試驗所提取白花蛇舌草DNA條帶清晰、明亮、無拖尾；DNA樣品的D260 nm/D280 nm=1.83，介于1.80～2.0之間，說明DNA樣品的純度較高，能滿足后續(xù)試驗的需要。

表3 白花蛇舌草ISSR-PCR正交試驗設計

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，引物濃度在0.500～0.625 μmmol/L時，擴增出的條帶數(shù)多且較為清晰明亮；濃度降低時，條帶暗淡，條數(shù)減少；濃度增大時，條帶異常明亮，粘連在一起，特異性降低。由圖2可知，當Mg2+濃度為1.0～2.0 mmol/L時，擴增的條帶少，且不清晰，當濃度為2.5 mmol/L時，條帶逐漸增多，當濃度為3.5 mmol/L時，擴增條帶亮度降低。由于Mg2+是TaqDNA聚合酶的輔助因子，其濃度影響TaqDNA聚合酶的活性，又兼在保證特異性條帶和清晰度的情況下，確定ISSR體系中Mg2+濃度2.50～3.25 mmol/L。由圖3可知，dNTPs濃度在0.150～0.375 mmol/L時，條帶清晰明亮，特異性強，濃度增大時，條帶數(shù)減少，亮度降低。由圖4可知，DNA量在20、40、60、80、100 ng時，條帶均清晰明亮，特異性強，但考慮到試驗成本，故確定正交試驗中DNA量的范圍是20～80 ng。由圖5可知，TaqDNA聚合酶量在1.5～2.0 U時，條帶相對清晰明亮，無拖尾，特異性強。

2.3 正交試驗結(jié)果

由圖6可知，依照遺傳多樣性分析要求，對正交試驗PCR結(jié)果依次打分， 結(jié)果中條帶穩(wěn)定、清晰、豐富的最佳產(chǎn)物記為16分， 最差的記為1分。編號1～16打分結(jié)果依次為 2、12、12、10、3、9、10、9、14、16、7、13、11、12、7、1。根據(jù)打分結(jié)果算出每個因素同水平下的均值和極差，見表4。

2.4 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

由圖7可知，當退火溫度為56.2～57.0℃時，擴增條帶少，部分條帶缺失；退火溫度為50.9～53.2 ℃時，擴增條帶少且模糊，亮度較低；退火溫度在47.0～48.9 ℃時，由于溫度過低導致擴增條帶背景彌漫，難以分辨，當退火溫度為55.0 ℃時，條帶數(shù)目多且清晰明亮，因此確定55.0 ℃為UBC826號引物的最佳退火溫度。

表4 各因素水平下的均值和極差

3 討論與結(jié)論

影響白花蛇舌草擴增反應效果的主要因素包括引物濃度、dNTPs濃度、DNA模板量、Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶量等。在本試驗中，dNTPs濃度對擴增反應的影響最大，dNTPs濃度過高可加快反應速度，同時也增加堿基的錯誤摻入率和試驗成本；反之，低濃度的dNTPs會導致反應速度的下降，但可提高試驗的精確性。由于dNTPs可能與Mg2+結(jié)合，因此應注意dNTPs濃度和Mg2+濃度之間的關系。如果dNTPs的濃度達到1 mmol/L，則會抑制TaqDNA聚合酶的活性。引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物增加、引物之間易形成二聚體，濃度太低又可能得不到擴增結(jié)果或產(chǎn)量過低。最佳的Mg2+濃度對于不同的引物和模板都不相同，較高的濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實度。TaqDNA聚合酶量過高，會引起非特異性產(chǎn)物的擴增；濃度過低則合成產(chǎn)物量減少，得不到預期的PCR產(chǎn)物產(chǎn)量。

本試驗運用單因素結(jié)合正交設計的方法，首先確定各因素用量或濃度的有效范圍，再利用正交設計進行優(yōu)化組合，確立了白花蛇舌草的最佳20 μL ISSR-PCR反應體系：引物濃度0.562 5 μmol/L，Mg2+濃度2.75 mmol/L，dNTPs濃度 0.375 mmol/L，DNA模板60 ng，TaqDNA聚合酶1.25 U，2.0 μL 10×TaqBuffer，其余用ddH2O補齊，為以后開展白花蛇舌草ISSR多態(tài)性的相關研究奠定了基礎。