氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)和生理的影響

史 俊， 楊鶴同， 徐 超， 席剛俊

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物，分布于安徽、浙江、福建、廣西、四川及云南等地海拔800～1 500 m山地覆有苔蘚或腐殖質(zhì)的巖石或樹干上[1]，其為富含多糖、生物堿、氨基酸及礦物質(zhì)等多種有益于人體健康的藥用活性成分，具有益胃生津、滋陰清熱、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等功效[1-4]，鐵皮石斛在自然狀態(tài)下自身繁殖困難，由于長(zhǎng)期毀滅性采挖與生存環(huán)境破壞，造成野生資源瀕臨滅絕，現(xiàn)已將鐵皮石斛列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)瀕危藥用植物[5]，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物品種之一。通過人工手段繁殖和栽培鐵皮石斛是滿足市場(chǎng)需求的主要手段，同時(shí)也對(duì)保護(hù)野生鐵皮石斛資源具有重要意義。

氮素是所有植物體生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期不能缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，是組成植物體內(nèi)氨基酸、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)以及葉綠素和其他關(guān)鍵有機(jī)分子的基本組成成分之一，所有植物體的正常生長(zhǎng)發(fā)育都需要氮素來維持，但是氮素的過量攝入也會(huì)對(duì)植物造成嚴(yán)重傷害[6]。張珂等通過研究水氮互作對(duì)菘藍(lán)光合生理影響發(fā)現(xiàn)，在適宜的中氮水平下，菘藍(lán)的光合作用最強(qiáng)，而低水平供氮會(huì)使菘藍(lán)光合作用受到抑制[7]。Shu等研究發(fā)現(xiàn)，在低氮條件下，高羊茅葉片中葉綠素含量降低，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 和過氧化物酶(peroxidase，POD)活力卻顯著增強(qiáng)[8]。氮素不僅會(huì)影響植物體內(nèi)在的光合作用，而且還通過影響體內(nèi)一些重要的酶類控制植物的生理生化代謝，進(jìn)而對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量產(chǎn)生極大的影響[9]。鐵皮石斛的生長(zhǎng)離不開氮素營(yíng)養(yǎng)，但氮素營(yíng)養(yǎng)提供過多或過少都會(huì)對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)及生理指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。目前，針對(duì)培養(yǎng)基中氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)及生理指標(biāo)影響的研究鮮見報(bào)道。 本研究以鐵皮石斛組培苗為材料，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的氮素，分析氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的影響，從而為完善鐵皮石斛組培快繁技術(shù)及提高田間施肥管理水平提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛果實(shí)于2015年11月采自浙江樂清，經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院張治國(guó)研究員鑒定為鐵皮石斛的果實(shí)，2015年12月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院組培中心將鐵皮石斛種子消毒后，接種到培養(yǎng)基(N6+NAA 0.1 mg/L+馬鈴薯汁80 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L)上培養(yǎng)3個(gè)月，形成原球莖后轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基(N6+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥80 g/L+瓊脂 7 g/L+蔗糖30 g/L)上培養(yǎng)3個(gè)月獲得試管苗，選擇長(zhǎng)勢(shì)相近、株高 2～3 cm的試管苗作為供試材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 基本培養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基，添加NAA 1.0 mg/L、瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L，通過調(diào)整(NH4)2SO4和KNO3濃度設(shè)置5種不同的氮素水平，分別為低氮水平(0.01、0.2 mmol/L)、中氮水平(5、10 mmol/L)、高氮水平(35 mmol/L)TN(全氮)，分別標(biāo)記為N1、N2、N3、N4、N5(CK)。將鐵皮石斛組培苗接種培養(yǎng)基，每瓶接種18株，每個(gè)處理接種5瓶，3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)室培養(yǎng)50 d，培養(yǎng)條件為：(25±2) ℃，光照1 000 lx，12 h/d。

1.2.2 形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 分別隨機(jī)取10株苗測(cè)量株高、根長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，稱取全株鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、根干質(zhì)量等生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.2.3 生理指標(biāo)測(cè)定 分別隨機(jī)選取10株苗，剪取葉片，去除粗大的主葉脈，測(cè)定葉綠素、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)、游離脯氨酸(Pro)含量及SOD、POD活力，葉綠素、MDA含量測(cè)定分別采用80%丙酮研磨法[10]、硫代巴比妥酸法[11]；游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD、POD活力測(cè)定參照高俊鳳的方法[12]。切取幼苗根尖，TTC法測(cè)定根系活力[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)的影響

從表1可以看出，鐵皮石斛的生根數(shù)量隨著氮素濃度的提高呈現(xiàn)下降—升高—下降的趨勢(shì)，說明低氮水平有利于鐵皮石斛生根，在供氮水平達(dá)10 mmol/L時(shí)，平均株高、平均根鮮質(zhì)量、平均根干質(zhì)量、平均全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、折干率都達(dá)到最大值，并且優(yōu)于高氮處理N5，但N4處理鮮根占全株的比重最低，而干根占比卻不是最低，說明此時(shí)更多的水分進(jìn)入了植株的地上部分，地上部分代謝更加旺盛，發(fā)育較快?？傮w看來，低氮水平促進(jìn)鐵皮石斛地下部分的生長(zhǎng)，中氮水平地上部分生長(zhǎng)快于地下部分，而當(dāng)?shù)厮竭_(dá)到一定水平后，地下部分生長(zhǎng)加速，提高了根占比，但在生根數(shù)、根長(zhǎng)、株高等表觀生長(zhǎng)指標(biāo)上各處理間均無顯著差異，只有在折干率指標(biāo)上，各處理呈現(xiàn)顯著差異，并以N4處理最高，由此可見一定量的供氮水平對(duì)鐵皮石斛組培苗干物質(zhì)積累影響很大。

2.2 不同氮素水平對(duì)鐵皮石斛根系活力及有機(jī)滲透物的影響

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部的營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。脯氨酸與可溶性蛋白是非常重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是缺氮脅迫下植物生理變化規(guī)律的重要參考指標(biāo)。由表2可知，在低氮條件下，鐵皮石斛根系活力得到加強(qiáng)，隨著氮素增加，鐵皮石斛根系活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，氮素水平最低的為N1處理，其根系活力分別是N3、N4、N5處理的1.30、1.40、1.39倍，并且呈顯著差異。不同供氮水平下，鐵皮石斛體內(nèi)的脯氨酸和可溶性蛋白含量存在差異，在中低氮水平(N1～N3)下有機(jī)滲透物脯氨酸和可溶性蛋白含量隨供氮水平的增加而提高，在高氮水平下，隨氮素增加而下降。中氮水平(N3)脯氨酸和可溶性蛋白水平最高，脯氮酸與可溶性蛋白含量分別達(dá)到0.003 3%和 0.002 3 mg/g，其脯氨酸含量與其他處理呈顯著差異。

表1 氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)的影響

注：不同小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平。下表同。

表2 不同供氮水平對(duì)鐵皮石斛根系活力及有機(jī)滲透物的影響

2.3 不同氮素水平對(duì)鐵皮石斛葉綠素含量的影響

葉綠素含量直接反映光合作用的強(qiáng)度，氮素是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的重要組成元素，氮素的供應(yīng)對(duì)植物葉綠素的合成有重要的影響。由表3可以看出，鐵皮石斛葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量在N3處理時(shí)達(dá)到最大，分別為N1處理葉綠素a、總?cè)~綠素、葉綠素b的1.44、1.41、1.43倍，且其葉綠素a和總?cè)~綠素含量與最低水平N1處理呈顯著差異。以上結(jié)果表明，氮素的供應(yīng)對(duì)鐵皮石斛葉綠素的合成有重要影響，葉綠素的合成需要一定量的氮素供應(yīng)，但過高的氮素水平對(duì)葉綠素的合成有抑制作用。

表3 不同供氮水平對(duì)鐵皮石斛葉綠素含量的影響

2.4 不同氮素水平對(duì)鐵皮石斛組培苗活性氧清除系統(tǒng)的影響

MDA作為膜脂過氧化過程中的主要產(chǎn)物之一，其含量的變化可反映細(xì)胞膜脂損傷程度[15]。植物體內(nèi)存在的 SOD、POD 等抗氧化酶系，對(duì)清除植物體內(nèi)的過量活性氧、維持活性氧的代謝平衡、防御膜脂過氧化等具有積極的作用[14]，從表4中可以看出，鐵皮石斛植株體內(nèi)MDA的含量隨著供氮水平的不斷提高而不斷降低，SOD活力隨著供氮水平的提高而呈升高—下降—升高的趨勢(shì)，POD水平在中低氮水平(N1～N3)下隨氮素水平增加而提高，在N3時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)后便快速降低。由此可見，低氮脅迫導(dǎo)致鐵皮石斛生物膜脂過氧化，SOD、POD等抗氧化酶活性降低，隨著供氮水平的提高，SOD、POD等抗氧化酶活力增強(qiáng)，MDA水平下降，但較高的氮素水平首先會(huì)抑制鐵皮石斛POD的活力。

表4 不同供氮水平對(duì)鐵皮石斛MDA含量及抗氧化酶活力的影響

2.5 不同氮素水平對(duì)鐵皮石斛組培苗根莖葉中氮素分布的影響

不同的氮素水平對(duì)鐵皮石斛根、莖、葉的氮素含量及氮素在根莖葉中的分布有很大影響，從表5中可知，總體上來說，鐵皮石斛根莖葉中含氮量隨著供氮水平的提高而提高，在根、葉中，當(dāng)供氮水平為N4處理時(shí)，氮素含量快速提高，分別達(dá)到38.005、45.228 mg/g，并與N1和N2處理呈顯著差異，而莖中的含氮量卻在N4處理時(shí)呈下降趨勢(shì)，在N5處理中又大幅度上升。從氮素在鐵皮石斛根莖葉中的分布情況來說，在低氮水平(N1、N2)處理時(shí)，根的氮素含量水平顯著高于莖，并且N2處理時(shí)跟中氮素水平顯著高于莖葉；在中氮水平(N3、N4)處理時(shí)，鐵皮石斛根莖葉中的含氮量出現(xiàn)分化，根和葉的含氮量快速增加，并且葉片中含氮量積累速度明顯快于根，當(dāng)?shù)窟_(dá)到N4時(shí)，葉片中含氮量達(dá)到最大值，并與根呈顯著差異性；當(dāng)供氮水平進(jìn)一步提高時(shí)，葉片中的含氮量不再增加，但根和莖中的含氮量繼續(xù)提高，且根中含氮量提高的速度快于莖，這說明在氮素缺乏的條件下，鐵皮石斛首先保證營(yíng)養(yǎng)吸收器官(根)的活力，其次是營(yíng)養(yǎng)合成器官(葉片)，最后是營(yíng)養(yǎng)貯存器官(莖)。

3 討論

氮元素是作物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，也是作物生長(zhǎng)的重要限制因子[16-17]。在植物的生長(zhǎng)過程中，氮素營(yíng)養(yǎng)含量對(duì)植物的生長(zhǎng)代謝及生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響。氮素營(yíng)養(yǎng)水平不僅直接影響含氮化合物(葉綠素、生物堿等)的合成，且與非含氮化合物(類胡蘿卜素、類黃酮等)的合成也有密切關(guān)系[18]。

在本試驗(yàn)中，不同的供氮水平對(duì)于鐵皮石斛的生長(zhǎng)具有明顯的影響，總體呈現(xiàn)先升高再降低再升高的趨勢(shì)，部分處理間呈現(xiàn)顯著差異，在N4水平上，其生根數(shù)量、根鮮干質(zhì)量、全株鮮干質(zhì)量、平均株高、折干率等方面達(dá)到最優(yōu)，并優(yōu)于全氮培養(yǎng)的對(duì)照，這與尤麗莉等研究[19]一致。但鐵皮石斛的根系活力卻隨著供氮水平的提高而持續(xù)降低，可能是由于在輕易得到氮素供應(yīng)的條件下，植株減緩了根系的發(fā)育。

表5 不同供氮水平對(duì)鐵皮石斛根、莖、葉中氮素分布的影響

注：不同小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平。括號(hào)里字母表示橫向比較，括號(hào)外字母表示縱向比較。

植物葉片中葉綠素合成、SOD和POD活力也受氮素的影響，低氮條件下，葉綠素合成受到抑制，光合作用下降，SOD和POD活力受到抑制，MDA水平升高，隨著供氮水平的提高，葉片中葉綠素合成抑制逐步解除，光合作用增強(qiáng)，同時(shí)SOD和POD活力增強(qiáng)，MDA水平逐步下降，由此可以看出，MDA含量與抗氧化酶活力系統(tǒng)及葉綠素含量呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡，在較高的供氮水平下，葉綠素水平的提高減少了葉片光合作用的過剩光能，降低了過量活性氧的產(chǎn)生，從而降低了對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的損害及MDA的產(chǎn)生，而抗氧化酶SOD和POD活力的提高又進(jìn)一步緩解了這一傷害，MDA水平逐步下降，但過量的氮素并不能進(jìn)一步提高葉綠素含量，還會(huì)對(duì)POD活力產(chǎn)生影響，這與前人的研究[20-23]一致。從氮素在植株體內(nèi)的分布來看，在低水平供氮條件下，植株體內(nèi)氮素分布較為均一，根部氮素略高于莖葉，在N4水平時(shí)，氮素快速向根葉轉(zhuǎn)移。這與葉綠素的合成規(guī)律一致。

綜上所述，鐵皮石斛在低氮(N1、N2)水平下，植株體內(nèi)代謝處于被抑制狀態(tài)，N3水平時(shí)，植株體內(nèi)代謝開始恢復(fù)，N4水平時(shí)，植株體內(nèi)代謝水平最高，因此鐵皮石斛種苗的最佳的供氮水平為5～10 mmol/L。