劉笑笑， 王 瑩， 仇建飛， 孟繁磊， 魏春雁

[吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(長(zhǎng)春)，吉林長(zhǎng)春 130033]

小麥的種植面積僅次于水稻，是我國(guó)一半人口的主糧，小麥及其制品的質(zhì)量安全直接關(guān)系到我國(guó)的食品安全[1]。北方地區(qū)由于氣候條件限制，小麥種植基本以春小麥為主。北方春麥區(qū)主要包括黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地區(qū)，在全國(guó)小麥生產(chǎn)中占有重要地位。小麥赤霉病別稱紅麥頭、麥穗枯、爛麥頭，是長(zhǎng)江流域冬麥區(qū)以及北方春麥區(qū)常發(fā)性病害，該病是由多種鐮刀菌引起的，亞洲鐮刀菌(Fusarumasiaticum)和禾谷鐮刀菌(F.graminearum)是引起小麥赤霉病的優(yōu)勢(shì)致病種群[2-5]。近年來(lái)，該病害流行范圍明顯由南向北轉(zhuǎn)移[6]。鐮刀菌不僅影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)而造成經(jīng)濟(jì)損失，更重要的是其產(chǎn)生的代謝物——鐮刀菌毒素，不管是食用還是飼用，對(duì)人和畜禽都存在安全風(fēng)險(xiǎn)。鐮刀菌毒素對(duì)人和畜禽的肝臟、腎臟、細(xì)胞免疫機(jī)能等都有不同程度的毒性作用，甚至對(duì)腫瘤的發(fā)生有一定的影響[7-16]，因而鐮刀菌毒素被列入自然發(fā)生的最危險(xiǎn)的食品污染物之一[17-18]。為明確北方春麥區(qū)鐮刀菌種群結(jié)構(gòu)、毒素化學(xué)型分布特點(diǎn)以及毒素污染情況，本研究對(duì)2016年采集自北方春麥區(qū)(吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古等地區(qū))的55份小麥樣品致病種群鐮刀菌單孢菌株進(jìn)行分離、毒素化學(xué)型鑒定及單體毒素的定性定量檢測(cè)，旨在明確鐮刀菌在北方春麥區(qū)的分布與毒素污染情況，對(duì)人們食用安全小麥以及小麥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試樣品 在小麥?zhǔn)崭钇?，從吉林省的松原市、白城市、四平市，黑龍江省的齊齊哈爾市、黑河市(含九三農(nóng)場(chǎng))，內(nèi)蒙古自治區(qū)的呼倫貝爾盟、巴彥淖爾盟等7個(gè)地區(qū)分別收集小麥麥粒，共采集55份樣品，每份樣品質(zhì)量為2.5 kg。

1.1.2 化學(xué)試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱PDA)培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；引物DNA、瓊脂糖N和DNA提取試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；預(yù)混DNA聚合酶，購(gòu)自長(zhǎng)春海靈科貿(mào)有限公司；甲醇(色譜純)，購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；甲酸(分析純)，購(gòu)自西隴化工股份有限公司；乙腈(色譜純)，購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；乙酸(分析純)，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑一廠；玉米赤霉烯酮(zearalenone，簡(jiǎn)稱ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON)、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱3-AcDON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-acetyl-deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱15-AcDON)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(deoxynivalenol-3-glucoside，簡(jiǎn)稱D3G)、雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，簡(jiǎn)稱NIV)(純度≥99%)，均購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；瓊脂粉，購(gòu)自北京依托生物。

1.1.3 儀器設(shè)備 Presoclave Ⅱ型高壓滅菌鍋，購(gòu)自西班牙Selecta公司；SW-CJ超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DNP-9162BS-Ⅲ恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CX21FS1顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司；C1000 PCR儀(伯樂(lè))，購(gòu)自長(zhǎng)春美信科貿(mào)有限公司；DYY-8C 雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；CT15RE臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自日立工機(jī)株式會(huì)社；QTRAP 5500液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，購(gòu)自美國(guó) AB SCIEX 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 每份樣品稱取100 g，從中挑選小麥赤霉病病粒。用75%乙醇表面消毒30 s，1% NaClO表面消毒1 min，無(wú)菌水漂洗3次，滅菌濾紙吸干水分后分5點(diǎn)擺放在PDA培養(yǎng)基平板中，于25 ℃倒置培養(yǎng)72 h。將小麥籽粒周圍長(zhǎng)出的所有真菌挑出，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的PDA培養(yǎng)基平板中，25 ℃培養(yǎng)72 h后，在顯微鏡下觀察，帶有鐮刀狀大型分生孢子或橢圓形小型分生孢子的真菌，則為鐮刀菌。

用20 mL無(wú)菌水將真菌洗掉，使其菌絲、孢子充分混勻，將混合液通過(guò)3層擦鏡紙過(guò)濾，孢子在濾液中，加水稀釋，涂至水瓊脂培養(yǎng)基平板上，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，將僅有1個(gè)分生孢子的水瓊脂轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng) 72 h 后挑取新鮮菌絲轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，置于4 ℃保存，即獲得鐮刀菌單孢菌株。

1.2.2 菌絲培養(yǎng)和DNA提取 挑取每個(gè)菌株至PDA培養(yǎng)基平皿中，于25 ℃靜置培養(yǎng)72 h，收集菌絲用于DNA提取試驗(yàn)。DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡(jiǎn)稱CTAB)法。將干凈的研砵、研杵、藥匙滅菌備用，將CTAB提取液置于65 ℃水浴鍋中預(yù)熱，先加入少量滅菌的石碤砂，然后加入適量菌絲體再加入 1 000 μL 事先預(yù)熱的CTAB，迅速研磨后分裝于離心管中，反復(fù)顛倒，使其迅速混溶，65 ℃水浴1 h，其間每隔15 min拿出顛倒混勻1次。取出冷卻后，加入等體積的苯酚氯仿，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻后，于常溫14 000 r/min條件下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，待白色絮狀沉淀出現(xiàn)，或可放置-20 ℃冰箱30 min以上，于常溫8 000 r/min條件下離心5 min，倒干上清液，加入 1 000 μL 75%乙醇，輕輕搖勻，8 000 r/min離心5 min，漂洗2次，晾干后，加適量TE緩沖液，4 ℃溶解。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。

1.2.3 鐮刀菌種的鑒定 采用Yang等的研究方法[3，6]，對(duì)84株鐮刀菌用FgCTPSf024、FgCTPSr536、FgCTPSf177、FgCTPSr306等4條引物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)PCR擴(kuò)增，此為第1組競(jìng)爭(zhēng)PCR擴(kuò)增。采用25 μL擴(kuò)增體系：1.0 μL DNA模板，2.0 μL dNTPs，2.5 μL PCR緩沖液，0.5 μLTaq酶，1.0 μL FgCTPSf 177，1.0 μL FgCTPSr306，0.5 μL FgCTPSf024，0.5 μL FgCTPSr536，用無(wú)菌水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用FgTEFf124、FgTEFf364、FgTEFr411、FgTEFr590等4條引物進(jìn)行第2組競(jìng)爭(zhēng)PCR擴(kuò)增。4條引物分別添加 0.50、0.50、0.25、0.25 μL，其他組分和擴(kuò)增反應(yīng)程序與第1組競(jìng)爭(zhēng)PCR相同。

對(duì)于非禾谷鐮刀菌群(F.graminearumclade，簡(jiǎn)稱Fgclade)菌株，用燕麥鐮刀菌(F.avenaeum)種的特異性引物(FaF/FaR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系中引物分別添加1 μL，其他組分與上述反應(yīng)體系相同。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。以上PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2.4 毒素化學(xué)型的測(cè)定 測(cè)定DON和NIV毒素化學(xué)型時(shí)，使用TOXP1和TOXP2引物，各0.5 μL，其他反應(yīng)組分同“1.2.3”節(jié)。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用Jennings等的方法[19]對(duì)DON毒素化學(xué)型的菌株進(jìn)行3-AcDON和 15-AcDON 鑒定。2個(gè)PCR反應(yīng)所須引物分別為0.5 μL Tri303F/Tri303R、0.5 μL Tri315F/Tri315R，其他反應(yīng)組分同“1.2.3”節(jié)。擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 鐮刀菌毒素檢測(cè) 準(zhǔn)確稱取5.000 g小麥樣品(麥粒磨成的麥粉)于離心管中，加入25 mL提取液(乙腈、水、乙酸的體積比為80 ∶19 ∶1)，振蕩1.5 h，超聲提取30 min，14 000 r/min 離心15 min，取1 mL上清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，上液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：色譜柱為Kinetex SB-C18，2.1 mm×100 mm×1.7 μm；柱溫為 40 ℃；進(jìn)樣量為3 μL；流動(dòng)相組成：A相為10%甲醇(含0.1%甲酸)，B相為甲醇；流速為0.3 mL/min。質(zhì)譜條件：電離源模式為電噴霧離子化；電離源極性為正負(fù)模式同時(shí)掃描；霧化器為氮?dú)?；檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌菌株的分離與致病菌種群結(jié)構(gòu)分析

共分離獲得84株單孢菌株，各地分離的單孢菌株情況見(jiàn)表2。84株單孢菌株中，共檢測(cè)到亞洲鐮刀菌、F.acaciae-meansii、燕麥鐮刀菌、F.meridionale、禾谷鐮刀菌等5個(gè)鐮刀菌種。除內(nèi)蒙古巴彥淖爾盟地區(qū)外，其余采樣地區(qū)均檢測(cè)到禾谷鐮刀菌菌株，占所有菌株的42.86%；其次有2個(gè)采樣地區(qū)檢測(cè)到亞洲鐮刀菌，占所有分離菌株的27.38%。各采樣地區(qū)的鐮刀菌致病種存在差異，吉林省鐮刀菌種群相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)到5個(gè)鐮刀菌菌種；黑龍江省檢測(cè)到F.acaciae-meansii、F.meridionale、禾谷鐮刀菌等3個(gè)種；內(nèi)蒙古檢測(cè)到亞洲鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等3個(gè)種，且主要集中在亞洲鐮刀菌和禾谷鐮刀菌2個(gè)種。這與Gale等的研究結(jié)果[4-5]一致。亞洲鐮刀菌在吉林省的小麥赤霉單孢分離物中檢測(cè)到12株，在內(nèi)蒙古檢測(cè)到2株，該結(jié)果與Parry報(bào)道的亞洲鐮刀菌主要分布于涼爽或海洋性氣候地區(qū)[4]較為吻合。

表2 不同采樣地點(diǎn)鐮刀菌種群分布情況

2.2 PCR鑒定結(jié)果

由圖1可知，亞洲鐮刀菌菌株擴(kuò)增出4條條帶，分別為536、388、311、162 bp，引物FgCTPSf177和FgCTPSr306在亞洲鐮刀菌菌株上擴(kuò)增出162 bp的特征條帶；FgCTPSr306和FgCTPSf024在Fgclade中擴(kuò)增出311、536 bp的特征條帶； FgCTPSf024和FgCTPSr536在F.meridionale菌株上擴(kuò)增出536 bp的特征條帶。

由圖2可知，F(xiàn)gclade菌株擴(kuò)增出482 bp條帶，禾谷鐮刀菌菌株擴(kuò)增出261 bp條帶，F(xiàn).acaciae-meansii擴(kuò)增出306 bp條帶。而燕麥鐮刀菌菌株擴(kuò)增出920 bp特征帶。

由圖3、圖4可知，用引物ToxP1/ToxP2區(qū)分DON和NIV毒素，DON毒素的特征條帶為300 bp，NIV毒素的特征條帶為360 bp。DON毒素菌株中，引物Tri303F/Tri303R擴(kuò)增出583 bp條帶的菌株為3-AcDON，引物Tri315F/Tri315R擴(kuò)增出863 bp條帶的菌株為15-AcDON。

2.3 鐮刀菌毒素化學(xué)型分析

由表3可知，DON和NIV毒素化學(xué)型之間存在明顯的地域分布。DON毒素化學(xué)型是北方春麥區(qū)赤霉病病菌的優(yōu)勢(shì)毒素類型，而NIV毒素化學(xué)型僅在吉林省麥區(qū)出現(xiàn)。在產(chǎn)生DON毒素化學(xué)型的菌株中，北方春麥區(qū)DON毒素類型均以15-AcDON為主。zhang等研究表明，DON是我國(guó)小麥赤霉病病菌產(chǎn)生主要的毒素化學(xué)類型，且北方冷涼地區(qū)以產(chǎn)生 15-AcDON為主，南方溫暖地區(qū)以產(chǎn)生3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-AcDON)為主[5，20-21]，本研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致。菌株產(chǎn)生乙酰DON毒素的類型與該菌株所屬種存在一定關(guān)系。亞洲鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等3種菌株主要產(chǎn)生15-AcDON；F.acaciae-meansii和F.meridionale這2種菌株只產(chǎn)生15-AcDON。

2.5 鐮刀菌毒素檢測(cè)結(jié)果與分析

對(duì)北方春小麥中雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙?；撗跹└牭毒┐?、15-乙?；撗跹└牭毒┐嫉?種B型鐮刀菌毒素進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，3個(gè)省(自治區(qū))7個(gè)市(盟)所有被檢樣品中，6種毒素均未檢出。可能是病害程度較輕，毒素水平很低，再者可能是小麥皮對(duì)籽粒起到了保護(hù)作用。6種毒素的檢出限見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

北方春麥區(qū)小麥鐮刀菌病害預(yù)防應(yīng)以亞洲鐮刀菌和禾谷鐮刀菌為主，生物毒素污染預(yù)防應(yīng)以15-AcDON為主；6種B型鐮刀菌生物毒素在被檢樣品中均未檢出，表明北方春麥區(qū)小麥整體質(zhì)量安全水平較高。

表3 各省鐮刀菌毒素化學(xué)型分布情況

表4 鐮刀菌毒素檢出限