黨參多糖的分離純化及抗衰老作用研究

張 濤， 楊婉羚， 曹 喻， 董澤令， 閔 迅

(1.遵義醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，貴州遵義 563003)

多糖也稱聚糖，是由多種單糖如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等，通過脫水連接在一起的生物大分子[1]。研究表明，多糖是中草藥的有效成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2]，是構(gòu)成植物細胞壁的主要成分，一般采取熱水煮提法獲得多糖，試驗操作方便，對于多糖分子的結(jié)構(gòu)破壞性較小，產(chǎn)率較高。

黨參(CodonopsispilosulaNannf.)是我國傳統(tǒng)的中藥材，且藥食兩用，具有抗氧化、補氣補血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性[3]。研究表明，黨參的活性成分包括多糖、甾醇類等活性分子[4]。對黨參主要成分多糖的研究自20世紀(jì)80年代就已開展，發(fā)現(xiàn)黨參多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性[5]，如經(jīng)黨參多糖處理后衰老模型小鼠的血清中丙二醛和腦中褐質(zhì)含量下降明顯，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性上升明顯，推測黨參多糖抗衰老與其清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化相關(guān)[6]。但是目前關(guān)于黨參抗氧化活性方面的研究不全面，黨參多糖中的主要抗氧化活性成分不完全明確，阻礙了黨參多糖的結(jié)構(gòu)及藥理活性研究。本試驗通過提取、分離純化及體內(nèi)外抗衰老活性試驗，對黨參多糖進行了較為系統(tǒng)的研究，能夠促進黨參多糖類抗衰老藥品的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

黨參購于貴州仙龍藥業(yè)有限公司；牛血清白蛋白級分V購于羅氏公司；間羥基聯(lián)苯、氨基磺酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購于Sigma公司；三氟乙酸購于國藥集團；D-半乳糖(D-Gal)、乙醇、苯酚、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙酸鈉、氯化鈉和維生素C等購于北京化工廠；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和過氧化氫酶(CAT)試劑盒購于上海索寶生物公司。昆明系小鼠購于第三軍醫(yī)大學(xué)。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(723型)購于上海光譜儀器有限公司；電子天平(ME104)購于梅特勒-托利多公司；冷凍干燥器購于北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋購于北京泰澤瑞達科技有限公司；蘭格蠕動泵(BT01-100)購于保定蘭格恒流泵有限公司；自動部分收集器(BS-100A)購于上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 黨參多糖的制備

稱取500 g黨參，洗凈后，先后分別于100 ℃ 8 L及 100 ℃ 6 L蒸餾水中連續(xù)煮提2次，每次煮提4 h。將提取液濃縮至約700 mL，離心后收集上清并加入4倍體積的95%乙醇進行沉淀，離心收集多糖沉淀，利用Sevag法除蛋白后凍干，即得黨參多糖(CodonopsospilosulaNannf. pdysaccharide，簡稱CPNP)。

1.4 黨參多糖的分離純化

稱取20 g的黨參多糖溶于200 mL蒸餾水中，上樣于DEAE-纖維素離子交換柱(8.0 cm×20 cm，Cl-型)。依次用蒸餾水(2 L)、0.1 mol/L NaCl(2 L)和0.3 mol/L NaCl(2 L)進行洗脫，流速12 mL/min，每200 mL洗脫液收集1次。采用苯酚-硫酸法檢測洗脫液中的糖含量。根據(jù)糖含量的分布圖，收集適當(dāng)?shù)南疵撘?，?jīng)蒸餾水透析除鹽后，凍干備用。

1.5 多糖的單糖組成分析

稱取多糖約2 mg于水解小瓶中，加入1.0 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液(TFA)，于120 ℃水解5 h；將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入適量的無水乙醇，蒸干，除掉三氟乙酸；用超純水復(fù)溶蒸干的水解產(chǎn)物，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待離子色譜分析；采用Thermo ICS-5000+配備脈沖安培檢測器，離子柱為Carbo PAC PA20(3.0 mm×150 mm)。根據(jù)Liang等建立的淋洗條件進行檢測，流速0.4 mL/min，柱溫28 ℃[7]。

1.6 黨參多糖的分子量分布分析

稱取多糖約2 mg，溶于0.2 mol/L NaCl溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待高效凝膠滲透色譜(high performence gel permeation chromatography，簡稱HPGPC)分析。標(biāo)準(zhǔn)品聚糖系列，平均分子量分別為12、50、150、270、410、670 ku。以上述標(biāo)準(zhǔn)聚糖的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的保留時間為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及多糖的保留時間計算出多糖的分子量。采用島津LC-20AT系列高效液相色譜儀配備示差折光檢測器，分子篩柱為TSK-gel G4000PWXL(7.8 mm×300 mm)，流動相為0.2 mol/L NaCl水溶液，流速為0.5 mL/min。

1.7 體外抗衰老試驗

1.7.1 對DPPH的清除能力 將黨參多糖的子級分溶于蒸餾水中，配成不同濃度的溶液(0～4.0 mg/mL)。取不同濃度的多糖溶液4 mL分別與1 mL DPPH溶液(0.1 mol/L)混合，避光孵育20 min?？瞻讓φ諡檎麴s水，陽性對照為維生素C。DPPH清除率=(1-D多糖/D蒸餾水)×100%，其中D多糖和D蒸餾水為溶液在517 nm處的吸光度[8]。

1.8 衰老模型小鼠試驗

選擇體質(zhì)量20～25 g雄性小鼠30只，隨機分為蒸餾水空白組、衰老模型對照組、黨參多糖組，每組10只。3組于皮下注射D-半乳糖(生理鹽水配成5%)構(gòu)建衰老模型小鼠[10]，連續(xù)40 d。黨參多糖灌胃劑量為400 mg/kg，另2組灌胃同體積蒸餾水。連續(xù)灌胃30 d，末次灌胃2 h后，小鼠眼眶取血，測定血SOD和CAT的活性，結(jié)果計算按試劑盒說明進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參多糖的分離純化

利用DEAE-纖維素柱對黨參多糖進行分離純化，分別用0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液對黨參多糖進行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得到黨參多糖子級分多糖-1(CodonopsispilosuiaNannf. sub-polysaccharide-1，簡稱CPNP-1)和黨參多糖子級分多糖-2(CodonopsispilosuiaNannf. sub-polysaccharide-2，簡稱CPNP-2)2個級分的產(chǎn)率分別為 30.6% 和19.8%，二者均富含糖醛酸(圖1)。

2.2 黨參多糖級分CPNP-1和CPNP-2的單糖組成

采用高效離子色譜法檢測黨參多糖各級分的單糖組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黨參多糖的子級分CPNP-1主要含有19.8%半乳糖醛酸(galacturonic acid，簡稱GalA)、23.9%半乳糖(galactose，簡稱Gal)、22.1%阿拉伯糖(arabinoss，簡稱Ara)和26.7葡萄糖(glucose，簡稱Glc)，還含有4.6%鼠李糖(rhamnose，簡稱Rha)和2.9%葡萄糖醛酸(glucuronic acid，簡稱GlcA)。CPNP-2主要含有GalA(32.2%)、Rha(17.9%)、Gal(17.2%)和Ara(28.3%)，以及少量的Glc(2.1%)和GlcA(2.3%)；二者Rha/GalA的比例分別為0.23和0.56，均在Ⅰ型-鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamngalacturonan Ⅰ，簡稱RG-Ⅰ)型果膠的定義范圍之內(nèi)(0.05～1.0)[11](圖2)。推測CPNP-1和CPNP-2都屬于RG-Ⅰ型果膠，并且可能帶有Ⅰ/Ⅱ型-阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan Ⅰ/Ⅱ，簡稱Ⅰ/Ⅱ-AG)側(cè)鏈。

2.3 黨參多糖級分CPNP-1和CPNP-2的分子量

利用高效凝膠排阻色譜聯(lián)合TSK-gel G4000PWXL分子篩對DEAE-纖維素柱分級得到的CPNP-1和CPNP-2分子量進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPNP-1和CPNP-2的分子量分別約為51、23 ku，且均一性良好，CPNP-2呈現(xiàn)對稱且較窄的峰型(圖3)。

2.4 黨參多糖體外抗衰老活性

對黨參多糖子級分CPNP-1和CPNP-2的DPPH清除能力進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPNP-1和CPNP-2都具有良好的DPPH自由基和超氧負陰離子的清除能力，且活性隨著2種多糖濃度的增加而增強，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。在多糖濃度為0～4mg/mL的范圍內(nèi)，CPNP-1的DPPH自由基和超氧負陰離子50%有效的清除濃度分別3.6、2.1 mg/mL；CPNP-2的自由基和超氧負陰離子50%有效的清除濃度分別為1.3、0.9 mg/mL。CPNP-2的DPPH自由基和超氧負陰離子的清除能力均強于CPNP-1(圖4)。

2.5 衰老模型小鼠試驗

通過建立衰老模型小鼠，檢測血清中SOD和CAT的活性，進而分析黨參多糖子級分CPNP-2的活性，結(jié)果如表1所示。與衰老模型對照組相比，CPNP-2組血清中SOD和CAT活性顯著升高(P<0.01)，且與蒸餾水空白對照組差異不明顯，表明黨參多糖子級分CPNP-2可以緩解衰老模型小鼠血清的SOD和CAT活性下降。

3 結(jié)論與討論

表1 衰老模型小鼠各組血清中SOD和CAT活性

注：**表示與模型組比較差異極顯著(P<0.01)。