杜立新，宋 健，賈海民，曹偉平，李耀發(fā)，張 曉

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050031)

川芎(LigusticumchuanxiongHort)，屬傘形科藁本屬，多年生草本植物，其干燥根莖是我國(guó)傳統(tǒng)中藥[1]。川芎主產(chǎn)自云貴川地區(qū)，我國(guó)華北地區(qū)也有栽培[2]。川芎是有活血、散風(fēng)、止痛的功效，與其他藥物搭配可治療冠心病、心絞痛等病癥[3-5]。近年來，川芎的經(jīng)濟(jì)價(jià)值客觀，成為農(nóng)業(yè)增收的主要栽培作物之一。隨著種植面積的擴(kuò)大，川芎病蟲害發(fā)生日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響到川芎的產(chǎn)量、品質(zhì)及農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。研究表明，生產(chǎn)上為害川芎的主要害蟲有莖節(jié)蛾、斜紋夜蛾、蠐螬、紅蜘蛛和種蠅等[6]，還未見有韭菜遲眼蕈蚊(Bradysiaodoriphaga)為害川芎的相關(guān)報(bào)道。

韭菜遲眼蕈蚊，屬雙翅目、眼蕈蚊科、遲眼蕈蚊屬，在我國(guó)廣泛分布，是我國(guó)的特有害蟲[7]。該蟲主要為害百合科、藜科、菊科、十字花科、葫蘆科和傘形科等6科30多種蔬菜[8-9]。韭菜遲眼蕈蚊主要靠幼蟲群居在蔬菜根莖部位進(jìn)行啃食為害，造成植株枯萎、甚至死亡，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

2017年9月河北省安國(guó)市川芎種植戶反映當(dāng)?shù)刂兴幉拇ㄜ撼霈F(xiàn)大量黃葉、死苗現(xiàn)象，根莖部嚴(yán)重受害，河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所組織相關(guān)人員初步鑒定為根蛆為害。本研究對(duì)安國(guó)市川芎根蛆的為害情況進(jìn)行了調(diào)查，并通過成蟲形態(tài)鑒定結(jié)合DNA條形碼技術(shù)對(duì)川芎根蛆種類進(jìn)行了鑒定，旨在為川芎根蛆的綠色防控提供理論科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 川芎根蛆為害情況

2017年9月10日在河北省安國(guó)市對(duì)川芎根蛆發(fā)生為危害情況進(jìn)行調(diào)查。在地塊內(nèi)調(diào)查采取“Z”型5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)連續(xù)調(diào)查10株川芎，記錄川芎被害株數(shù)、死株數(shù)和每株川芎塊莖根蛆幼蟲蟲口數(shù)量，計(jì)算蟲株率、死苗率和單株蟲口數(shù)量。

1.2 供試?yán)ハx

川芎根蛆：于2017年9月10日采自河北省安國(guó)市霍莊村。采集的根蛆幼蟲1/2直接用于分子生物學(xué)鑒定試驗(yàn)，1/2繼代飼養(yǎng)至成蟲用于形態(tài)特征鑒定。羽化成蟲后，將成蟲標(biāo)本與韭菜遲眼蕈蚊成蟲形態(tài)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行初步的形態(tài)鑒定。

韭菜遲眼蕈蚊：河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物殺蟲劑課題組室內(nèi)飼養(yǎng)種群，采用韭菜鱗莖在90 mm培養(yǎng)皿中，于人工氣候室中(寧波東南儀器廠)連續(xù)飼養(yǎng)多代，溫度(25±1)℃、光周期16L∶8D、相對(duì)濕度70%。

1.3 川芎根蛆分子鑒定

1.3.1 總DNA提取 參考TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書方法分別對(duì)川芎根蛆和韭菜遲眼蕈蚊幼蟲DNA進(jìn)行提取，每個(gè)調(diào)查點(diǎn)隨機(jī)選取3頭川芎根蛆幼蟲，共計(jì)90頭；選取韭菜遲眼蕈蚊幼蟲3頭作為對(duì)照。所得的DNA于-20 ℃保存。

1.3.2 PCR反應(yīng)條件 所用引物為通用引物L(fēng)CO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT CA-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為710 bp左右。PCR擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，GoldViewⅠ染色后在紫外透視儀上觀察，記錄結(jié)果。

1.3.4 序列鑒定 將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。每個(gè)樣品 3個(gè)重復(fù)。將所測(cè)得的川芎根蛆的mtDNA-COI序列在GenBank中進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 川芎根蛆為害情況

川芎根蛆為害率為4%～82%，死苗率可達(dá)22%，單株平均蟲口數(shù)量可達(dá)37.76頭，不同地塊間存在顯著差異(表1)。川芎根蛆主要以幼蟲鉆駐川芎根莖部為害，導(dǎo)致地上葉片萎蔫；嚴(yán)重時(shí)將根莖挖空，造成整株川芎死亡(圖1)；川芎根蛆點(diǎn)片發(fā)生分布不均勻。

2.2 川芎根蛆形態(tài)鑒定

經(jīng)川芎根蛆成蟲與韭菜遲眼蕈蚊成蟲形態(tài)特征比對(duì)，初步明確該蟲為雙翅目(Diptera)眼蕈蚊科(Mycetophilidae)遲眼蕈蚊屬(Bradysiawinnertz)韭菜遲眼蕈蚊(Bradysiaodoriphaga)，韭菜遲眼蕈蚊屬全變態(tài)昆蟲，在個(gè)體發(fā)育中，經(jīng)過卵、幼蟲、蛹和成蟲等4個(gè)時(shí)期，卵，橢圓形，孵化前變?nèi)榘咨识褷?，?dāng)卵殼上出現(xiàn)小黑點(diǎn)時(shí)即將孵化；幼蟲，體細(xì)長(zhǎng)，頭漆黑色有光澤，初半透明狀后呈乳白色，共4齡，老熟幼蟲體長(zhǎng)5.5～7.0 mm。蛹，裸蛹，體長(zhǎng)2.7～4.0 mm，長(zhǎng)橢圓形，初期黃白色，后轉(zhuǎn)黃褐色，羽化前成灰黑色。成蟲，體細(xì)長(zhǎng)，黑褐色，形似蚊子。雄成蟲體長(zhǎng)3.0～5.0 mm，頭小，復(fù)眼發(fā)達(dá)；觸角絲狀，16節(jié)，其梗節(jié)粗大呈球形；胸部發(fā)達(dá)，背面隆起；足細(xì)長(zhǎng)，前足脛節(jié)端部具脛梳5根和1根距，中、后足各2根距；前翅長(zhǎng)2.2～2.9 mm，寬1.0～1.2 mm，具有淡紫色金屬閃光，翅脈褐色，后翅退化為平衡棒。腹部背面1～8節(jié)各有一塊長(zhǎng)方形的黑斑，節(jié)間膜乳白色，外生殖器寬大，其端節(jié)向內(nèi)彎，使抱器形成鉗狀，頂葉端具6～7根粗刺。雌成蟲體長(zhǎng)4～5 mm，與雄蟲基本相似，但觸角短且細(xì)，腹部中段粗大，向端部漸細(xì)而尖，腹端具1對(duì)分為2節(jié)的尾須[11-12]。

表1 川芎根蛆為害情況調(diào)查結(jié)果Tab.1 Survey on damage to Chuanxiong by root maggot

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan′s 新復(fù)極差法檢測(cè)在 5%水平上差異著。

Note: Data were mean±SE, data in a column with the different lowercase letters are significantly different at 0.05 level using Duncan′s range test.

圖1 川芎根蛆為害川芎植株及根莖癥狀Fig.1 The harm symptoms of Chuanxiong plants and rhizome symptoms by root maggots

M. DL2000 Marker；1-5. 川芎根蛆5個(gè)樣品。M. DL2000 Marker;1-5. Five samples of Chuanxiong root maggot.

2.3 川芎根蛆分子鑒定

由圖2可知，PCR產(chǎn)物片段大小均在709 bp左右(圖2)，與預(yù)期產(chǎn)物大小相近，可以初步判定該產(chǎn)物是所需的目的片段。測(cè)序結(jié)果顯示，所有樣品序列均約710 bp，序列相似性為99%；將川芎根蛆(Root maggot)mtDNA-COI序列(圖3)在NCBI中進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與韭菜遲眼蕈蚊 isolate ShenweimtCOI序列相似性為99%。

2.4 川芎根蛆系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建川芎根蛆的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，川芎根蛆與韭菜遲眼蕈蚊B.odoriphagaisolate Shenwei聚合在一起(圖4)，再與韭菜遲眼蕈蚊B.odoriphagaisolate Huaishang、B.odoriphagaisolate Lumiao、B.odoriphagaisolate Duji、B.odoriphagaisolate Nidian和B.odoriphagaisolate Yanji聚在一起，而與尖眼蕈蚊科KP038529.1 Sciaridae sp. BOLD:AAH3919 voucher BIOUG04652-B01COIgene、KP044556.1 Sciaridae sp. BOLD:ACE0776 voucher BIOUG04645-C12COIgene和KP046352.1 Sciaridae sp. BOLD:AAH3919 voucher BIOUG04652-H05COIgene相距較遠(yuǎn)，說明川芎根蛆屬于韭菜遲眼蕈蚊。

圖3 川芎根蛆與韭菜遲眼蕈蚊 isolate Shenwei mtDNA-COI序列比對(duì)Fig.3 mtDNA-COI gene sequence comparison between B. odoriphaga isolate Shenwei and Chuanxiong root maggot

圖4 基于川芎田韭菜遲眼蕈蚊mtDNA-COI基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of mtDNA-COI gene in Bradysia odoriphaga from Chuanxiong

3 討論

韭菜遲眼蕈蚊在我國(guó)分布廣泛，東至東北遼寧、西至甘肅、北至內(nèi)蒙古、南至臺(tái)灣等18個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)均有分布，其中以河北、山東、天津、黑龍江等北方各省受害嚴(yán)重[13]。此外，韭菜遲眼蕈蚊寄主種類繁多，其中以韭菜、圓蔥、大蒜、萵苣為主，近年來，韭菜遲眼蕈蚊在菊科生菜上為害也非常嚴(yán)重[14-15]。目前報(bào)道為害中藥材的根蛆種類主要以種蠅為主，本研究根據(jù)川芎根蛆成蟲形態(tài)特征與韭菜遲眼蕈蚊成蟲形態(tài)特征進(jìn)行比對(duì)，初步明確為害安國(guó)川芎田的根蛆種類為韭菜遲眼蕈蚊，后經(jīng)分子鑒定技術(shù)對(duì)川芎根蛆mtDNA-COI基因序列與韭菜遲眼蕈蚊mtDNA-COI序列比較，相似度達(dá)到99%，進(jìn)一步明確河北安國(guó)地區(qū)對(duì)川芎造成為害的根蛆為韭菜遲眼蕈蚊。韭菜遲眼蕈蚊在不同地區(qū)、不同作物、不同栽培模式和不同年份的發(fā)生規(guī)律均存在一定的差異。因此，韭菜遲眼蕈蚊在川芎上的發(fā)生規(guī)律還需要進(jìn)一步研究。

在雙翅目眼蕈蚊科中，因遲眼蕈蚊屬包含種類多且含有部分模糊的復(fù)合種，因此對(duì)其種類鑒定較困難，在形態(tài)學(xué)上存在很大爭(zhēng)議。目前對(duì)遲眼蕈蚊屬種類的鑒定是基于雄成蟲形態(tài)特征[16-17]。DNA技術(shù)(Barcoding)是利用基因組DNA上一段標(biāo)準(zhǔn)的或大家公認(rèn)的基因片段作為分子靶標(biāo)進(jìn)行種級(jí)水平的種類鑒定[18]。Shin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，利用DNA分子鑒定技術(shù)可對(duì)遲眼蕈蚊屬幼蟲種類進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(Cyto-chrome oxidase I，COI)，由于其相對(duì)容易擴(kuò)增，且其在種內(nèi)變異速率較小，在種間變異速率較大，已成為DNA條形碼在動(dòng)物界的主要分子標(biāo)記，被廣泛用于近緣物種間的系統(tǒng)進(jìn)化研究[20]。本研究采取成蟲形態(tài)學(xué)和mtDNA-COI分子標(biāo)記2 種鑒定方法對(duì)川芎根蛆的種類進(jìn)行了鑒定，共同明確了川芎根蛆即為韭菜遲眼蕈蚊，鑒定結(jié)果更加真實(shí)可靠。

本研究主要明確了造成安國(guó)川芎根莖部嚴(yán)重為害的根蛆種類及為害情況，為指導(dǎo)安國(guó)川芎根蛆的防控提供了目標(biāo)和方向。同時(shí)考慮到川芎主要以干燥的根莖入藥，在防治川芎根蛆時(shí)，建議主要采用綠色安全的防治措施[21]，重點(diǎn)采用輪作、物理誘殺[22]、生物源農(nóng)藥[23]等防治措施，必要時(shí)采用低毒、低殘留的化學(xué)藥劑進(jìn)行防治[24]。