李海洋，李愛學(xué)，王 成，王曉冬，侯佩臣，李文姣，陳 珂

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621000；2. 北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心，北京 100097)

目前世界上7%的土地已經(jīng)鹽堿化，并且在干旱半干旱地區(qū)越來越多的土地使用鹽水灌溉[1], 故鹽害已成為繼干旱之后的第二大環(huán)境問題。因此需要更好地了解植物的耐鹽機(jī)制，以最大限度地調(diào)節(jié)植物的生長條件，維持作物的生產(chǎn)力。

植物激素在調(diào)節(jié)植物對生物及非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。脫落酸(ABA)對多種逆境環(huán)境都會發(fā)生響應(yīng)。鹽脅迫下植物中的內(nèi)源ABA會有一定比例的增加，大多與葉片或土壤的水勢有關(guān)[2]。生長素(IAA)可以促進(jìn)細(xì)胞生長及側(cè)根和不定根的發(fā)生。研究報(bào)道，鹽脅迫下谷類等作物中IAA濃度增加，生長受到抑制[3]。赤霉素(GA)主要促進(jìn)植物莖節(jié)的伸長生長和花芽分化，鹽脅迫下GA與其它激素發(fā)生交互作用，共同調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[4]。玉米素核苷(ZR)與ABA 間的平衡作用影響氣孔的開閉, 從而在脅迫適應(yīng)中起重要作用[5，6]。不同的植物激素在植物體的不同部位合成，并分布到植物的其它部位發(fā)揮作用[7]。這些激素可能接近或遠(yuǎn)離其合成位點(diǎn)，以調(diào)節(jié)對環(huán)境刺激及發(fā)育變化的反應(yīng)[8]。同一激素在植物不同部位，其含量及作用不同；并且在植物的相同部位，激素含量不同，其發(fā)揮的作用也不同。因此，研究植物體不同部位在鹽脅迫下的內(nèi)源激素變化將有助于深入了解植物激素的作用機(jī)制及植物的耐鹽機(jī)理。

向日葵作為世界四大油料作物之一[9]，被許多國家廣泛種植[10]。目前，研究者們圍繞鹽脅迫下向日葵的生長和生理特征做了大量研究。于志賢等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對不同品種向日葵種子萌發(fā)均有抑制作用, 并且隨著鹽濃度升高, 抑制作用增大; 王偉等[12]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會影響向日葵的葉面積、株高、膜透性等。Ghader等[13]研究了鹽脅迫下向日葵根莖葉的生理生化變化。但鹽脅迫下苗期向日葵內(nèi)源激素變化鮮見報(bào)道。本研究對苗期向日葵進(jìn)行不同濃度和時(shí)間的鹽脅迫處理，分別測定了向日葵根、莖、葉中吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)及玉米素核苷(ZR)幾種主要內(nèi)源激素含量變化，旨在進(jìn)一步理解向日葵的耐鹽機(jī)理，從而為向日葵的品種篩選和生產(chǎn)管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用油葵種子品種LD5009(北京Kafry科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 向日葵培育 選取顆粒飽滿且大小一致的種子，使用5%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒10 min后，用無菌二次蒸餾水漂洗數(shù)次。將種子置于培養(yǎng)皿，底部墊上濾紙做發(fā)芽床，加入去離子水潤濕種子及濾紙，放入植物光照培養(yǎng)箱(光照/黑暗:10 h/14 h；25±2℃/18±1℃；光強(qiáng)4000lx；60%濕度)培養(yǎng)。待長出的胚根長度達(dá)到2～3 cm時(shí)，移至1/2 Hoagland營養(yǎng)液中水培。水培20 d，取相似生長狀態(tài)的植株，移入NaCl濃度為0、50、100 mmol·L-1的Hoagland營養(yǎng)液中，分別進(jìn)行10、20、30 h的鹽脅迫，每組10株。鹽脅迫處理10、20、30 h后，幼苗生長形態(tài)表現(xiàn)為表1，分別采集植物的根、莖、葉部分，保存在液氮中待處理。

1.2.2 樣品預(yù)處理 將每株向日葵的根、莖、葉三種樣品分別通過液氮研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取200 mg粉末樣品，加入2 mL提取液(CH3OH∶H2O∶HCl=2∶1∶0.002)，置于-20℃過夜提取。4℃下14 000 rpm離心5 min，吸取上清液。殘?jiān)尤? mL提取液混勻，相同條件離心再提取，合并上清液，然后過C-18固相萃取柱。渦旋振蕩后置于室溫下，用氮吹儀吹干除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容后待測。

1.2.3 樣品測定 吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供試劑盒及活性測定方法。采用酶聯(lián)免疫檢測儀(DG-3022A型，華東電子管廠)測定樣品內(nèi)源激素IAA、ABA、SA、ZR含量。

1.2.4 結(jié)果計(jì)算 根據(jù)Yang等[14]的方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線的橫坐標(biāo)用激素標(biāo)樣各濃度(ng·ml-1)的自然對數(shù)表示，縱坐標(biāo)用各濃度顯色值的Logit值表示。Logit值的計(jì)算方法如下：

其中,B0是0 ng·ml-1孔的顯色值，B是其它濃度的顯色值。待測樣品可根據(jù)其顯色值的Logit值從圖上查出其所含激素濃度(ng·ml-1)的自然對數(shù)，再經(jīng)過反對數(shù)即可知其激素的濃度(ng·ml-1)。求得樣品中激素的濃度后，再計(jì)算樣品中激素的含量(ng·g-1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對植物內(nèi)源激素IAA含量的影響

由表1可知，較低濃度的鹽脅迫作用時(shí)間超過10 h即可引起向日葵幼苗明顯的表型變化，100 mmol·L-1鹽脅迫處理30 h即可使其莖稈倒伏，造成較大損傷。鹽處理?xiàng)l件下幼苗的根、莖、葉中內(nèi)源激素IAA濃度的變化趨勢如圖1所示，對照組各部位IAA的濃度為莖(72.78±5.47 ng·g-1)>根(59.24±4.76 ng·g-1)>葉(52.16±4.03 ng·g-1)。由圖1b可知，在50 mmol·L-1的鹽脅迫時(shí)，IAA在0～20 h 內(nèi)隨時(shí)間的增加其含量也隨之增加，到20 h時(shí)達(dá)到最大值。期間葉片和莖稈IAA含量增加較為顯著。20 h后各組分的IAA含量急劇下降，30 h時(shí)莖稈和葉片的含量基本持平。在100 mmol·L-1鹽脅迫時(shí)(圖1c)，根部IAA變化趨勢與50 mmol·L-1時(shí)幾乎保持一致，但其葉片和莖稈IAA含量在10 h即達(dá)到最大值，然后迅速下降，20 h下降至低于根部含量。表明100 mmol·L-1鹽脅迫下，各組織部位IAA的變化幅度較50 mmol·L-1時(shí)更大，變化速度更快?？梢钥闯觯?鹽脅迫對向日葵不同組織部位IAA水平的影響不一致, 對葉片和莖稈IAA水平的影響要大于對根部的影響。并且鹽脅迫濃度越高，影響越大。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)IAA的合成部位主要在頂芽, 根部IAA的合成數(shù)量很少。因此，可能在脅迫初期，植物表現(xiàn)出對鹽脅迫的拮抗，使得葉片和莖稈的IAA含量急劇增大，而根部的增加則較為緩慢。脅迫后期植物的生長受到顯著影響，無法合成滿足生長所需的IAA，IAA含量總體呈現(xiàn)出下降趨勢。100 mmol·L-1鹽脅迫下，在20～30 h期間，葉片和莖稈IAA含量有一個(gè)上升的趨勢，可能是鹽脅迫時(shí)，IAA含量的下降呈波動性，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表1 鹽脅迫下向日葵幼苗的表型變化

2.2 鹽脅迫對植物內(nèi)源激素ABA含量的影響

鹽處理?xiàng)l件下幼苗根、莖、葉中內(nèi)源激素ABA含量的變化趨勢如圖2所示，由圖2a可知，對照組的ABA在向日葵根、莖、葉中的含量不同，葉(68.55±10.99 ng·g-1)>根(37.53±4.85 ng·g-1)>莖(32.43±5.23 ng·g-1)。由圖2b可知，在50 mmol·L-1鹽脅迫下，向日葵根部ABA含量變化并不大，隨著脅迫時(shí)間的增加緩慢上升，后期則趨于穩(wěn)定，而在100 mmol·L-1鹽脅迫下，根部ABA含量變化則較為明顯。50 mmol·L-1鹽脅迫時(shí)(圖2b)，0～10 h葉片中ABA含量急劇上升至原來的2倍，而10～20 h時(shí)其含量下降，在20～30 h期間其下降趨勢趨于平緩。100 mmol·L-1鹽脅迫時(shí)(圖2c)，各組織ABA含量的變化趨勢與50 mmol·L-1時(shí)幾乎一致，但葉片中ABA的含量下降幅度更大。Jiménez等[16]研究發(fā)現(xiàn)逆境條件會大大增強(qiáng)植物ABA的生物合成，脅迫條件下, ABA的積累主要來自ABA釋放和新ABA的合成。ABA主要在根部合成，然后運(yùn)輸?shù)狡渌课籟17]。在對照組，ABA在葉片中含量最高，表明ABA主要運(yùn)輸?shù)饺~片中。脅迫初期，ABA表現(xiàn)增高趨勢，表明ABA在抵抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用，其中葉片中ABA的增加值高于根系和莖稈，表明鹽脅迫對植物葉片的影響最顯著，因此引起的植物應(yīng)激反應(yīng)也最強(qiáng)，使得合成的ABA大量運(yùn)輸?shù)饺~片中。隨著時(shí)間的延長，植物不再耐受鹽脅迫，生長受到抑制， ABA合成減少，根部合成的ABA不能再向上傳輸?shù)饺~片，因此葉片中ABA的含量下降也最明顯。

圖1 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內(nèi)源IAA含量變化Fig.1 The variation of endogenous IAA content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

圖2 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內(nèi)源ABA含量的變化Fig.2 The variation of endogenous ABA content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

2.3 鹽脅迫對植物內(nèi)源激素GA含量的影響

GA可以促進(jìn)植物莖節(jié)的伸長生長及花芽分化。鹽處理?xiàng)l件下幼苗根、莖、葉中內(nèi)源激素GA含量變化趨勢如圖3所示。由圖3a可知, GA在向日葵幼苗的根系、莖稈與葉片中含量較少，均小于10 ng·g-1，且含量相當(dāng)接近。在濃度為50 mmol·L-1的鹽脅迫下(圖3b)，向日葵根、莖、葉各組織GA含量變化均保持在 2.0 ng·g-1范圍內(nèi)，其中葉片和根部都隨脅迫時(shí)間的增加保持著平穩(wěn)的下降趨勢，莖稈在脅迫過程中GA含量有稍許的增加，之后又緩慢下降，在30 h 時(shí)向日葵的各組織的GA含量幾乎在同一水平。100 mmol·L-1的鹽脅迫下(圖3c)向日葵根、莖、葉GA也無明顯變化，各組織GA含量變化均在2.0 ng·g-1范圍內(nèi)。莖稈和葉片的含量隨脅迫時(shí)間的增加幾乎保持同一水平，沒有明顯的變化，根系GA含量表現(xiàn)為輕微的下降趨勢。結(jié)果表明50 mmol·L-1及100 mmol·L-1鹽脅迫下，向日葵根、莖、葉中GA含量的變化并不顯著，可能與我們采用的是低鹽脅迫，其濃度還不足以引起GA濃度發(fā)生較大變化有關(guān)。

2.4 鹽脅迫對植物內(nèi)源激素ZR含量的影響

鹽脅迫下向日葵幼苗根、莖、葉中內(nèi)源激素ZR含量的變化趨勢如圖4所示。由圖4a可知，向日葵內(nèi)源ZR的含量也相對較少，對照組各組織中的含量為根(9.40±0.49 ng·g-1)>葉(8.64±0.35 ng·g-1)>莖(5.80±0.79 ng·g-1)。在50 mmol·L-1鹽脅迫下(圖4b)，莖稈和葉片中ZR先上升，后下降，而根部ZR在0～20 h時(shí)，含量較為穩(wěn)定，20 h后開始下降，但下降趨勢低于莖稈和葉片。100 mmol·L-1鹽脅迫時(shí)(圖4c)向日葵根、莖、葉GA變化趨勢與50 mmol·L-1鹽脅迫時(shí)較為相似，總體呈下降趨勢，對莖稈及葉片的影響要大于根部。這一變化可能與ZR在根部合成有關(guān)。脅迫初期，植物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，根部合成ZR[18]，供給自身需要并向上運(yùn)輸?shù)角o稈和葉片部位，而后期植物不再耐受鹽脅迫，ZR的合成減少，不能再運(yùn)輸?shù)饺~片和莖稈部位。因此葉片和莖稈部位下降趨勢較根部明顯。

2.5 鹽脅迫對植物向日葵各組織中內(nèi)源激素比例的影響

植物對鹽脅迫的響應(yīng)不是由單一激素的絕對含量決定，而是與各種植物激素的綜合調(diào)控有關(guān)。研究指出，IAA與ABA 是發(fā)揮拮抗作用的激素, 二者的比值變化影響著植物器官的生長與脫落; GA與ABA的比值可以影響種子萌發(fā)、性別分化及植物休眠等生理活動。(ZR+IAA+GA)/ABA則可反映幾種激素的平衡狀態(tài)。鹽脅迫下向日葵不同部位內(nèi)源激素間比值如表2所示。由表2可知，在50 mmol·L-1鹽脅迫下，IAA/ABA，GA/ABA，(ZR+IAA+GA)/ABA三種形式的激素比值均出現(xiàn)一個(gè)有規(guī)律的波動，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，表現(xiàn)為脅迫初期激素比值顯著下降，之后出現(xiàn)顯著回升，并再次下降，且后一次下降的趨勢顯著高于前一次(P<0.05)，這種波動趨勢表現(xiàn)了植物對鹽脅迫的拮抗，但最終激素含量表現(xiàn)為下降趨勢，植物生長受到抑制，且向日葵植株的根、莖、葉均表現(xiàn)了類似的趨勢。100 mmol·L-1鹽脅迫下，向日葵根、莖、葉中IAA/ABA，GA/ABA，(ZR+IAA+GA)/ABA激素比值的變化趨勢顯著高于50 mmol·L-1鹽脅迫(P<0.05),說明高濃度鹽脅迫對植物造成了更大的損傷， ABA主要在根部合成有關(guān)，同時(shí)高濃度脅迫使根部合成的激素不能運(yùn)輸?shù)角o稈和葉片，進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)。

圖3 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內(nèi)源GA含量的變化Fig.3 The variation of endogenous GA content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

圖4 鹽脅迫下向日葵根莖葉中內(nèi)源ZR含量的變化Fig.4 The variation of endogenous ZR content in the root, stem， and leaves of sunflower seedlings under salt stress

激素比例Hormone ratio植物組織Plant tissueCK50 mmol·L-110 h20 h30 h100 mmol·L-110 h20 h30 hIAA/ABA根 Root1.58±0.36b1.27±0.21d1.76±0.43a 0.49±0.12f1.48±0.32c 1.60±0.17b0.80±0.11e 莖 Stem2.24±0.55b 1.87±0.44d 2.29±0.24b 0.91±0.13e 2.94±0.63a0.96±0.04e2.12±0.25c 葉 Leaf0.76±0.21a 0.70±0.12b 0.77±0.07a 0.36±0.08d 0.73±0.07b 0.23±0.03e 0.50±0.03c GA/ABA根 Root0.21±0.02a 0.15±0.01c 0.17±0.01b 0.15±0.02c 0.18±0.02b 0.14±0.01c 0.18±0.01b 莖 Stem0.23±0.01a 0.20±0.02b 0.22±0.02a 0.16±0.01c 0.19±0.02b 0.20±0.02b 0.22±0.00a 葉 Leaf0.12±0.02a 0.06±0.02d 0.07±0.01c 0.06±0.01d 0.05±0.02e 0.08±0.01c 0.10±0.01b (ZR+IAA+GA)/ABA根 Root2.04±0.29b 1.61±0.28d 2.16±0.31a 0.78±0.07f 1.86±0.22c 1.92±0.33c 1.12±0. 23e 莖 Stem2.65±0.43b 2.20±0.41d 2.66±0.26b 1.17±0.17f 3.31±0.52a 1.25±0.22e 2.47±0.32c 葉 Leaf1.01±0.12a 0.75±0.09d 0.91±0.08b 0.46±0.03f 0.85±0.11c 0.36±0.01g 0.66±0.02e

注: IAA/ABA：吲哚乙酸與脫落酸的比值；GA/ABA：赤霉素與脫落酸的比值；(ZR+IAA+GA)/ABA：玉米素核苷、吲哚乙酸和赤霉素的總含量與脫落酸的比值。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: IAA/ABA：The ratio of indole 3-acetic acid to abscisic acid；GA/ABA：The ratio of gibberellin to abscisic acid；(ZR+IAA+GA)/ABA：The ratio of total contents of zein nucleoside, indole 3-acetic acid and gibberellin to abscisic acid。Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)源激素是一類重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。IAA、GA和ZR主要表現(xiàn)為促進(jìn)生長的作用，而ABA主要表現(xiàn)為生長抑制效果[19]。通過提高自身ABA含量來增加抗性，減緩細(xì)胞的分裂速度，從而降低生理需求以及水分蒸發(fā)[20]。顏宏等[21]研究了鹽脅迫下外源激素浸種對向日葵萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)ABA在緩解鹽脅迫影響的效果最佳。王鵬等[22]進(jìn)一步研究了向日葵在鹽脅迫下種子的發(fā)芽率以及種子發(fā)育期內(nèi)源激素含量變化，其發(fā)育期IAA含量隨著鹽濃度的增加而一直升高，而ABA含量隨鹽濃度增加表現(xiàn)為先平穩(wěn)后突增的趨勢。早期的研究主要側(cè)重于向日葵種子及整體性狀的研究，而植物激素在調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，并且植物的不同部位，植物激素的含量及作用均不同。因此有必要對鹽脅迫下向日葵不同組織內(nèi)源激素的變化進(jìn)行研究。Brady等[23]研究表明IAA和ABA之間存在信號的通信，ABA和IAA的含量變化可能是鹽脅迫影響植物發(fā)育的重要途徑。IAA與ABA之間存在拮抗作用[24]，二者的比值變化影響著植物器官生長與脫落。GA與ABA的比值可以影響種子萌發(fā)、性別分化及植物休眠等生理活動[25]，(ZR+IAA+GA)/ABA則可反映幾種激素的平衡狀態(tài)。本研究中也分別考察了向日葵根、莖、葉在鹽脅迫下各激素的比值隨鹽脅迫時(shí)間的變化。

本研究中鹽脅迫對苗期向日葵根、莖、葉中IAA， ABA 和ZR的變化較為明顯，表明這三種激素在鹽脅迫時(shí)發(fā)揮了重要作用。GA則沒有顯著變化，可能與使用的鹽濃度較低有關(guān)。IAA, ABA 和ZR這三種激素總體表現(xiàn)為先增加后下降的趨勢，鹽濃度越大，植物激素上升或下降的幅度越大，變化速度也越快。可能在脅迫初期，向日葵尚能通過調(diào)節(jié)這幾種激素的水平降低生理需求，抵抗脅迫。而脅迫后期，向日葵不能再繼續(xù)耐受，表現(xiàn)為激素合成下降，生長抑制。通過對根、莖、葉中這幾種激素水平的分析，發(fā)現(xiàn)向日葵的葉片和莖稈中這幾種激素的變化趨勢更為明顯，而根部的變化則較為緩慢，表明鹽脅迫對葉片及莖稈的影響更大。另外也與激素的合成及作用部位有關(guān)。

IAA、GA和ZR是生長促進(jìn)激素，ABA是抑制生長的激素，這幾種激素的比值反映了激素對植物的綜合調(diào)控。50 mmol·L-1鹽脅迫下，雖然向日葵根、莖、葉中IAA、ABA、GA和ZR這四種激素的變化趨勢不同，但I(xiàn)AA/ABA，GA/ABA，(ZR+IAA+GA)/ABA比值的變化趨勢相似，整體表現(xiàn)為波動性下降，表明向日葵各部位對鹽脅迫表現(xiàn)出一致的抵抗和耐受。而100 mmol·L-1鹽脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長，向日葵根、莖、葉中這幾種激素比值總體呈下降趨勢，但變化則不太一致，表明高濃度的鹽脅迫對植物造成了更大的傷害，使得各部位不能再協(xié)同調(diào)節(jié)，植物生長受到顯著影響。