涂招秀，謝欣，胡居吾＊，黃斌華

（1.江西省科學(xué)院，江西南昌 3300962；2.江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，江西贛州 330000）

蔓三七，又名平臥菊三七、蛇接骨、續(xù)命草、神仙草，其味辛、微苦、性涼，為多年生草本藥食兩用植物。蔓三七莖葉營養(yǎng)豐富，富含粗多糖和綠原酸，同時還含有總黃酮、維生素A、維生素C、氨基酸，富含有機鈣等成分。民間利用其通經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛，消炎止咳，治療跌打損傷，支氣管肺炎、肺結(jié)核等[1]。

現(xiàn)代生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證明，蔓三七具有通經(jīng)活絡(luò)，消炎止咳，散淤消腫，活血生肌等功效[2]；能延緩衰老、激活免疫細(xì)胞、改善機體免疫功能、提高人體免疫力，增強人體的新陳代謝并對記憶障礙有一定改善作用[3]；具有降血壓、降血糖和預(yù)防慢性腎病、抑制乙型肝炎的顯著效果[4]；對預(yù)防和治療心腦血管疾病、糖尿病等有一定的療效[5]；還具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志賀樣毒素細(xì)胞的活性[6]?？蓮V泛利用于食品醫(yī)藥工業(yè)、日用化工等領(lǐng)域，是一種極具潛力和高經(jīng)濟價值的藥食兩用植物。黃酮類化合物是蔓三七葉的主要活性成分之一，其中主要含蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷等[7]。

動態(tài)超高壓微射流技術(shù)能對物料起到強烈的剪切作用，并能產(chǎn)生高頻振蕩效果，同時給物料帶來高速的撞擊和壓力瞬間釋放等一系列的相互作用，從而導(dǎo)致物料的細(xì)胞或細(xì)胞壁破碎，從而使物料的活性成分溶出，而且它不會影響物料中的活性成分[8]。目前，動態(tài)超高壓微射流技術(shù)常用在對植物多糖的提取[9-10]、蛋白質(zhì)改性[11]等。運用動態(tài)超高壓微射流技術(shù)來提取黃酮的研究相對較少。

本文先采用進行單因素實驗，并在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，以蔓三七葉黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，優(yōu)化提取工藝；再以總抗氧化能力和對DPPH·和·OH清除率來評價蔓三七葉黃酮的抗氧化活性，研究結(jié)果對開發(fā)天然抗氧性化合物，綜合利用蔓三七葉資源，提高蔓三七葉的附加值具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓三七葉，江西華紫仁農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，烘干、粉碎后過20目篩備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Westgene公司；2,2-連氨基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、AAPH、Trolox，Aladdin 公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

MFIC高壓微射流均質(zhì)機（M-700 Series），美國Microfluidics公司；高壓均質(zhì)機（GY50-6S），上海華東高壓均質(zhì)機廠；可見分光光度計（722G），上海馳唐實業(yè)有限公司；電子分析天平（AL104），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蔓三七葉黃酮提取的流程

蔓三七葉粉末→一定濃度的乙醇浸泡→過夜→高壓預(yù)均質(zhì)（30 MPa，2次）→動態(tài)超高壓微射流均質(zhì)→乙醇冷凝回流提?。?0 ℃，2次）→ 合并提取液→離心→抽濾→測定吸光度→計算黃酮得率。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[12]

精確稱取在干燥溫度為120 ℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.200 0 g，置于100 mL容量瓶中，往容量瓶中加入80%乙醇70 mL，置于50 ℃水浴上邊加熱邊搖晃使其溶解，溶解完全后再冷卻至室溫，往容量瓶中再加入乙醇至刻度，搖勻。精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液。精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，先加乙醇6 mL，其次往容量瓶中加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min后，再容量瓶中加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，最后加5%氫氧化鈉試液10.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以乙醇為參比，用1 cm比色皿，于紫外可見分光光度計上，在400～600 nm波長處進行掃描。結(jié)果表明，對照品溶液在510 nm處有最大吸收，因此選擇510 nm作為測定波長。在510 nm波長處測定體系的吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為吸收度（A），橫坐標(biāo)為溶液濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.001x+0.0392，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，線性范圍在0～100 mg/mL。

1.2.3 單因素實驗

影響蔓三七葉黃酮得率的主要因素包括提取溫度、乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)、微射流均質(zhì)壓力和料液比等。通過前期的研究，確定液料比為15 mL/g，提取次數(shù)為2次。本實驗主要研究對蔓三七葉黃酮得率影響較大的因素有提取溫度、乙醇濃度、提取時間和微射流均質(zhì)壓力4個因素對蔓三七葉黃酮得率的影響。

1.2.4 正交實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、提取時間（B）和微射流均質(zhì)壓力（C）3個因素為自變量，由于提取溫度變化不顯著，設(shè)定為65 ℃。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以蔓三七葉黃酮得率（Y）為響應(yīng)值。因素水平編碼見表1。

表1 中心組合實驗設(shè)計因素水平

1.2.5 蔓三七葉黃酮體外抗氧化活性研究

1.2.5.1 總抗氧化能力的測定

參照李雪等[13]人方法，采用試劑盒測定蔓三七葉黃酮總抗氧化能力。按照T-AOC測定試劑盒說明書進行操作進行。根據(jù)公式（1）計算蔓三七葉黃酮及維生素C的總抗氧化能力（η總）：

式中：

N=反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（反應(yīng)液總量/取樣量）；

n=樣品測試前稀釋倍數(shù)。

在37℃時，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時，為一個總抗氧化單位。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照Najafian[14]等人方法，測定蔓三七葉黃酮對DPPH自由基清除效果。最后根據(jù)公式（2）計算蔓三七葉黃酮及維生素C的DPPH自由基清除率（ηDPPH）

1.2.5.3 OH自由基清除能力的測定

參照李雪[13]等人方法，測定蔓三七葉黃酮對OH自由基清除效果。最后根據(jù)公式（3）計算蔓三七葉黃酮及維生素C的OH自由基清除率（η·OH）：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0進行單因素方差分析、Origin8.5軟件作圖、Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計和統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g干燥的蔓三七葉粉末（過20目），按上述的液料比15 mL/g（體積/重量）加入分別為50%、60%、70%、80%和90%乙醇溶液，先經(jīng)過30 MPa預(yù)均質(zhì)后，在80 MPa微射流壓力下處理2次，65 ℃ 水浴提取1.5 h，提取兩次。

由圖1可知，蔓三七葉黃酮得率在50%～70%乙醇濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的上升而增大，并且在乙醇濃度為70%時達到最大值，此時得率為1.93%；在乙醇濃度70%～90%的范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度繼續(xù)上升，蔓三七葉黃酮得率緩慢下降，在乙醇濃度為90%時，蔓三七葉黃酮得率為1.82%。其原因可能是當(dāng)乙醇濃度大于70%，物料中的葉綠素等脂溶性雜質(zhì)大量的溶出，從而影響了黃酮物質(zhì)的溶出率。因此，選擇乙醇濃度為70%較合適。

圖1 乙醇濃度對蔓三七葉黃酮得率的影響

2.1.2 提取溫度對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15 mL/g加入70 %濃度的乙醇，浸泡過夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度選擇 50、55、60、65 ℃和 70 ℃ 水浴提取 1.5 h，提取2次，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在提取溫度為50～65 ℃范圍內(nèi)，蔓三七葉黃酮得率隨著提取溫度的上升而有所增加，但曲線上升趨勢不是太顯著，在提取溫度為50 ℃時，蔓三七葉黃酮得率為1.82%，而在提取溫度為65 ℃時，蔓三七葉黃酮得率為1.90%。當(dāng)提取溫度超過65℃后，蔓三七葉黃酮得率隨著溫度的上升（70 ℃）而緩慢下降，其原因可能是蔓三七葉黃酮中的某些活性成分被氧化分解。因此，選擇提取溫度為65 ℃較合適。

2.1.3 提取時間對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15 mL/g加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，立刻在80 MPa微射流壓力下處理2次，提取溫度65 ℃水浴提取，提取時間分別選擇0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，提取2次，結(jié)果如圖3所示。

圖2 提取溫度對蔓三七葉黃酮得率的影響

由圖3可知，在提取時間為0.5～1.5 h范圍內(nèi)，蔓三七葉黃酮得率會隨著提取時間的延長而增加，且蔓三七葉黃酮得率升高較快。在提取時間超過1.5 h后，蔓三七葉黃酮得率有下降的趨勢。因此，選擇提取時間為1.5 h較合適。

圖3 提取時間對蔓三七葉黃酮得率的影響

2.1.4 微射流均質(zhì)壓力對蔓三七葉黃酮得率的影響

分別稱取100.00 g蔓三七葉粉末，按液料比15 mL/g加入70%濃度的乙醇，浸泡過夜，經(jīng)30 MPa預(yù)均質(zhì)后，分別在立刻微射流均質(zhì)壓力選擇60、70、80、90 MPa和100 MPa下處理2次，提取溫度65 ℃水浴提取1.5 h，提取2次，結(jié)果如圖4所示。

相對于普通提取和高壓預(yù)均質(zhì)后提取，微射流均質(zhì)后再提取時，使得蔓三七葉黃酮得率隨著均質(zhì)壓力的加大而顯著提高，因為體系中均質(zhì)壓力越大，使得物料細(xì)胞的破碎程度越高，從而使得物料中黃酮物質(zhì)等有效成分更完全的溶出。從圖4可知，蔓三七葉黃酮的得率在微射流均質(zhì)壓力為90 MPa時達到最大值，蔓三七葉黃酮的得率達到1.94%。而后隨著均質(zhì)壓力的進一步加大，蔓三七葉黃酮得率趨于平緩且略微下降。因此，微射流均質(zhì)壓力90 MPa時，蔓三七葉黃酮得率最大。

圖4 微射流均質(zhì)壓力對蔓三七葉黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

單因素實驗結(jié)果表明，乙醇濃度、提取時間、微射流均質(zhì)壓力是影響得率的三個最主要的因素，由于提取溫度變化不顯著，設(shè)定為65 ℃，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以蔓三七葉黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對表2中的17個試驗點的響應(yīng)值進行多元回歸擬合后得到黃酮得率與各因素的二次多項回歸方程模型 R：

Y(%)=2.04-0.041A+0.026B+0.048C+0.030AB+0.0 13AC+0.017BC-0.12A2-0.085B2-0.14C2

由表3分析結(jié)果可知，表中F值越大表明該因素對黃酮得率影響越大，各因素對黃酮得率的影響大小依次為：均質(zhì)壓力（C）、乙醇濃度（A）、提取時間（B）。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3，整體模型的顯著性檢測p＜0.01，且失擬項為0.623 4，不顯著，說明該方程對試驗擬合較好，在此模型中A2、B2和C2是極顯著性因子項（p＜0.01），而B、AB、AC、BC無顯著性差異（p＞0.05）。

其中校正決定系數(shù)R2Adj=0.876 9＞0.80和變異系數(shù)（CV）為2.31%，可用來對提取蔓三七葉黃酮的工藝過程進行初步分析和預(yù)測。

表3 回歸模型的方差分析

2.2.2 驗證試驗

通過Design-Expert8.0.6 軟件求解方程，系統(tǒng)預(yù)測得出蔓三七葉黃酮得率的最佳工藝條件為：乙醇濃度67.56 %、提取時間68.06 min和均質(zhì)壓力79.57 MPa，在此條件下，模型預(yù)測得到黃酮得率為2.07%。為了檢驗響應(yīng)面優(yōu)化試驗所得到結(jié)果的可靠性，考慮到實際操作因素，將上述條件修正為：乙醇濃度68.0%、提取時間68 min和均質(zhì)壓力80 MPa，在此條件下黃酮得率為2.08%。黃酮得率實際值與預(yù)測理論值未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（p＞0.05），證明運用試驗建立的數(shù)學(xué)模型進行預(yù)測在實踐中是切實可行的，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.3 蔓三七葉黃酮的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化能力

不同質(zhì)量濃度蔓三七葉黃酮總抗氧化能力見圖5。由圖5可見，在各濃度下蔓三七葉黃酮總抗氧化能力與對照品維生素C的總抗氧化能力較接近，兩者的溶液濃度在0.8 mg/mL時，蔓三七葉黃酮總抗氧化能力值為（11.25±0.45）U/mL，維生素C總抗氧化能力值為（13.56±0.50）U/mL，蔓三七葉黃酮總抗氧化能力達到了維生素C總抗氧化能力值的90%以上，并且隨著溶液濃度增大，兩者的抗氧化能力都增強。可以看出，蔓三七葉黃酮總抗氧化能力較強。

圖5 蔓三七黃酮總抗氧化能力

2.3.2 對DPPH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度蔓三七葉黃酮對DPPH自由基清除能力見圖6。在各濃度下蔓三七葉黃酮與維生素C的DPPH 自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強趨勢。但蔓三七葉黃酮對DPPH 自由基清除能力低于Vc對DPPH 自由基清除能力，如在0.8 mg/mL時，蔓三七葉黃酮對DPPH自由基清除率為55.65%，而維生素C對DPPH 自由基清除率為90.2%。雖然蔓三七葉黃酮對DPPH自由基清除能力不及維生素C，但它對清除DPPH自由基還是具有較好的效果。

2.3.3 對OH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度蔓三七葉黃酮對OH自由基的清除能力見圖7。在各濃度下蔓三七葉黃酮與維生素C的OH自由基清除能力均隨著質(zhì)量濃度增大具有增強趨勢。蔓三七葉黃酮對OH自由基清除能力稍低于維生素C對OH自由基清除能力，在0.8 mg/mL時，蔓三七葉黃酮對OH自由基清除率為70.25%，維生素C對OH自由基清除率為86.7%，此濃度下蔓三七葉黃酮對OH自由基清除能力達到維生素C的80%以上，說明蔓三七葉黃酮對OH自由基清除能力較強。

圖6 蔓三七黃酮對DPPH自由基清除能力

圖7 蔓三七黃酮對OH自由基清除能力

3 結(jié)論

采用動態(tài)超高壓微射流技術(shù)提取蔓三七葉黃酮，通過單因素與響應(yīng)面實驗，建立了蔓三七葉黃酮得率的回歸模型。該模型測得出蔓三七葉黃酮得率的最佳工藝條件為：乙醇濃度68.0%、提取時間68 min和均質(zhì)壓力80 MPa，在此條件下黃酮得率為2.08%。在質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，蔓三七葉中黃酮體外抗氧化活性呈現(xiàn)出量效關(guān)系趨勢。0.8 mg/mL時，總抗氧化能力為（11.25±0.45）U/mL，達到相同溶液濃度的維生素C總抗氧化能力[（13.56±0.50）U/mL]的90%以上，各濃度蔓三七葉中黃酮對DPPH和·OH清除能力均有較強的清除能力，是一種良好的天然抗氧化劑。