何健，廖祖華，李小娟，戴金玉，高益槐

（安發(fā)（福建）生物科技有限公司，福建省天然生物活性物質(zhì)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建寧德 352100）

三萜類化合物是靈芝的主要活性成分，研究表明，靈芝三萜酸具有抑制癌細(xì)胞增殖、抗病毒、抑菌、解毒保肝等功能[1-4]。通過液體深層發(fā)酵獲得靈芝三萜酸，具有周期短、含量穩(wěn)定、組分一致等特點(diǎn)。李平作等[5]在25 L發(fā)酵罐進(jìn)行靈芝深層發(fā)酵，分離得到四環(huán)三萜酸，命名靈芝酸M1-3，產(chǎn)量是0.36 g/L。曠思敏等[6]通過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，搖瓶發(fā)酵靈芝三萜酸產(chǎn)量為0.50 g/L。王曉玲等[7]構(gòu)建了靈芝三萜酸分批發(fā)酵的非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型，靈芝三萜酸的合成和細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)部分偶聯(lián)關(guān)系。

在靈芝的生產(chǎn)放大過程中，種子培養(yǎng)的質(zhì)量和生物量是重要制約因素[8]。在培養(yǎng)過程中，靈芝孢子生長(zhǎng)出菌絲，由菌絲聚集纏繞形成菌絲球。隨著菌絲生長(zhǎng)和流體流動(dòng)，菌絲球會(huì)增大，并通過菌絲斷裂，形成新的菌絲球。生長(zhǎng)初期體積小的菌絲球得到充足的氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，隨著其體積的增大，傳遞到中心的氧受到限制。由于菌絲球直徑超過一定大小后就會(huì)產(chǎn)生氧限制，在無氧條件下會(huì)形成乙醇，而較長(zhǎng)時(shí)間的氧限制會(huì)導(dǎo)致菌絲球自溶[9]。通過對(duì)發(fā)酵種子培養(yǎng)的菌絲球進(jìn)行破碎，可在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期具有更多的生長(zhǎng)點(diǎn)、菌絲球獲得更充足的氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。

本文擬以三萜酸含量為主要指標(biāo)，對(duì)靈芝三萜酸深層發(fā)酵的種子培養(yǎng)過程中菌絲球破碎工藝進(jìn)行研究，為靈芝三萜酸發(fā)酵種子的快速擴(kuò)大培養(yǎng)、生產(chǎn)的規(guī)模化提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

靈芝NA34，赤芝G.10016+2，由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供，安發(fā)（福建）生物科技有限公司重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）。

種子培養(yǎng)基（包括一級(jí)和二級(jí)培養(yǎng)）：葡萄糖35 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉 5 g/L，KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖41 g/L、玉米粉17 g/L、豆餅粉5 g/L、蛋白胨4 g/L，KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L，調(diào)節(jié) pH 至 5.50。

1.3 主要設(shè)備

LRH-150F生化培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司），ZWY-1102C恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司），JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司），UV-2600紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），BLBIO-50SJQ 50L發(fā)酵罐（上海百侖生物科技有限公司）。

1.4 培養(yǎng)條件

菌種活化：將保藏的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5天。

一級(jí)種子培養(yǎng)：用接種耙取出已活化的斜面菌種并搗碎，接種于裝有80 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶，160 r/min、28 ℃培養(yǎng)4 d，即為一級(jí)種。

二級(jí)種子培養(yǎng)：將30 mL一級(jí)種接至裝有250 mL種子培養(yǎng)基500 mL搖瓶，160 r/min、28 ℃培養(yǎng)2 d，即為二級(jí)種。

發(fā)酵培養(yǎng)：將1 L二級(jí)種子液接種至裝有30 L發(fā)酵培養(yǎng)基50 L種子罐，發(fā)酵條件為160 r/min、溫度30 ℃、通氣量1 vvm、培養(yǎng)時(shí)間6 d。

1.5 分析方法

生物量的測(cè)定：取50 mL發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用蒸餾水洗滌菌絲體3次，60℃烘干至恒重得干燥菌絲體，精確稱重。

胞內(nèi)靈芝三萜酸含量的測(cè)定：將干燥獲得菌絲體用氯仿于750 W超聲波常溫提取2次，過濾合并濾液，減壓蒸干，用無水乙醇溶解，定容至容量瓶中。其三萜酸含量采用香草醛-高氯酸顯色法測(cè)定[10]。

菌絲球直徑測(cè)定：隨機(jī)選擇發(fā)酵液中20個(gè)菌絲球測(cè)量其直徑，取平均值。

1.6 菌絲球破碎工藝

對(duì)一級(jí)種分別采用超聲波破碎法和玻璃珠碾碎法，再接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行二級(jí)種培養(yǎng)，并與未進(jìn)行破碎工藝的結(jié)果進(jìn)行比較。

菌絲球超聲波破碎：選取按照1.4培養(yǎng)條件培養(yǎng)完成的一級(jí)種，于無菌條件下，將超聲波細(xì)胞破碎儀的探頭置于發(fā)酵液中650 W破碎6 s，再轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行二級(jí)種培養(yǎng)，并發(fā)酵培養(yǎng)。

菌絲球玻璃珠碾碎：在配制好的一級(jí)種種子培養(yǎng)基中加入10個(gè)玻璃珠（直徑5 mm左右），再進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌，按照培養(yǎng)方法培養(yǎng)一級(jí)種和二級(jí)種，并發(fā)酵培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌絲球破碎工藝對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響

靈芝的絲狀菌絲在液體深層發(fā)酵中菌絲球的生理形態(tài)特征是重要的參數(shù)，通過菌絲球破碎，可改變菌絲球的直徑、增加菌絲增長(zhǎng)點(diǎn)，進(jìn)而影響菌絲的比生長(zhǎng)速率、生物量、發(fā)酵液流變學(xué)特性、菌絲體供氧情況。

將同一批活化的菌株采用不同的菌絲球破碎工藝，比較不同工藝條件下二級(jí)種的菌絲球直徑、生物量及發(fā)酵后三萜酸含量等參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未進(jìn)行破碎菌絲球直徑為9.2 mm，超聲波破碎法和玻璃珠碾碎法菌絲球直徑分別為1.6 mm和6.2 mm，超聲波破碎法和玻璃珠碾碎法的生物量分別提高了60.3%和47.4%，三萜酸含量分別提高了53.6%和41.6%。

表1 不同的菌絲球破碎工藝對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)酵參數(shù)的影響

圖1 菌絲球形態(tài)

超聲波破碎法可快速地將菌絲球打碎，分散成短小的菌絲段，在二級(jí)種子培養(yǎng)中，菌絲可繼續(xù)生長(zhǎng)，產(chǎn)生更多生長(zhǎng)點(diǎn)，可獲得較高的生物量，且發(fā)酵得三萜酸含量也較高。

玻璃珠碾碎法可在菌絲體生長(zhǎng)過程中，玻璃珠對(duì)菌絲體持續(xù)的碰撞、研磨，可控制菌絲球直徑，增加散落菌絲數(shù)量，產(chǎn)生更多生長(zhǎng)點(diǎn)。采用此方法也可提高生物量，提高三萜酸產(chǎn)量，但比超聲波破碎法較低。

2.2 不同超聲條件對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響

培養(yǎng)完成的一級(jí)種于無菌條件下，將超聲波細(xì)胞破碎儀的探頭置于發(fā)酵液中650 W破碎，超聲時(shí)間分別為0 s、3 s、6 s、9 s、12 s，再轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行二級(jí)種培養(yǎng)，并發(fā)酵培養(yǎng)。

分析表2數(shù)據(jù)可知，超聲破碎時(shí)間與菌絲球直徑有負(fù)相關(guān)性，超聲破碎9s可獲得最大生物量，超聲破碎6 s三萜酸含量最高達(dá)320 mg/L。由于靈芝三萜酸為次級(jí)代謝產(chǎn)物，生物量與三萜酸含量沒有嚴(yán)格的相關(guān)性，故將三萜酸含量作為主要考察指標(biāo)，結(jié)合生物量情況，選擇超聲破碎6 s作為最適破碎條件。

2.3 添加玻璃珠的數(shù)量對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響

在配制好的一級(jí)種種子培養(yǎng)基中分別加入0個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)玻璃珠（直徑5 mm左右），再進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌，按照培養(yǎng)方法培養(yǎng)一級(jí)種和二級(jí)種，并發(fā)酵培養(yǎng)。

表3 玻璃珠的數(shù)量對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響

分析表3數(shù)據(jù)可知，提高玻璃珠數(shù)量有助于降低菌絲球直徑和提高生物量，加入20個(gè)玻璃珠可達(dá)最大生物量15.8 g/L和三萜酸含量305 mg/L，玻璃珠數(shù)量為10至25個(gè)時(shí)三萜酸含量可達(dá)最高值的97%以上。故250mL搖瓶裝液量80mL，加入20個(gè)玻璃珠進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵，生物量和靈芝三萜酸含量最高；加入玻璃珠數(shù)量為10至25個(gè)，可獲得較高的生物量和靈芝三萜酸產(chǎn)量。

表2 不同超聲破碎時(shí)間對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

在靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中，種子搖瓶培養(yǎng)時(shí)，菌絲與菌絲球不斷纏繞，使菌絲球直徑不斷增大。菌絲不易斷裂，產(chǎn)生新菌絲球速率較慢，新增長(zhǎng)點(diǎn)較少，得到菌絲球大小不一，菌絲球菌齡差異較大，制約了靈芝液態(tài)深層發(fā)酵的放大生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過考察超聲波破碎和玻璃珠碾碎兩種工藝對(duì)靈芝生長(zhǎng)和靈芝三萜酸發(fā)酵的影響，研究發(fā)現(xiàn)兩種破碎方法均可降低菌絲球直徑，增加菌絲球數(shù)量，提高生物量和三萜酸含量。

采用超聲波破碎法，將超聲波細(xì)胞破碎儀的探頭置于靈芝種子培養(yǎng)液中650 W破碎6 s，可獲得最高靈芝三萜酸含量320 mg/L。此方法可快速高效地將菌絲體破碎，且對(duì)菌絲體生長(zhǎng)影響小，可應(yīng)用于對(duì)菌種生物量有大量需求的生產(chǎn)中，可提高種子培養(yǎng)效率，提高菌種生物量，為靈芝三萜酸發(fā)酵階段提供基礎(chǔ)。但此方法為種子培養(yǎng)過程中進(jìn)行破碎處理，對(duì)細(xì)胞破碎機(jī)的超聲波探頭需嚴(yán)格無菌處理，操作不當(dāng)將大幅提高染菌風(fēng)險(xiǎn)。采用玻璃珠破碎法，250 mL搖瓶裝液量80 mL，加入20個(gè)玻璃珠進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵，生物量和靈芝三萜酸含量最高；加入玻璃珠數(shù)量為10至25個(gè)，可獲得較高的生物量和靈芝三萜酸產(chǎn)量。此方法操作簡(jiǎn)單，在小試實(shí)驗(yàn)中有較好的效果，多用于少量的搖瓶培養(yǎng)。

通過研究菌絲球的破碎工藝對(duì)靈芝三萜酸液態(tài)發(fā)酵的影響，提供超聲波破碎法和玻璃珠破碎法兩種破碎工藝，可高效的提高菌絲的增長(zhǎng)點(diǎn)，提高生物量，可為后續(xù)的靈芝三萜酸液態(tài)發(fā)酵研究提供基礎(chǔ)，同時(shí)也為廣大的絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)擴(kuò)大培養(yǎng)提供參考。