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(1.惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州516007；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊830002)

草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]，又叫腫節(jié)風(fēng)、九節(jié)茶等，具清熱涼血、鎮(zhèn)痛消炎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)消斑等作用，含黃酮、有機(jī)酸、酚類、鞣質(zhì)、香豆素和內(nèi)酯等成分[1]，其中有機(jī)酸成分為主要活性成分，如富馬酸、琥珀酸、原兒茶酸、棕櫚酸、硬脂酸、綠原酸、迷迭香酸[2]，已有草珊瑚含片、腫節(jié)風(fēng)注射液等多種劑型上市。本文根據(jù)酸堿作用原理，以堿水為溶劑，利用酚酸類成分與堿形成鹽，易溶于水，采用超聲波輔助提取，通過(guò)酸化提取液，使酚酸類成分形成沉淀析出，提高酚酸類成分提取率和純度。

1 儀器與材料

1.1 材料

草珊瑚藥材，2015年10月購(gòu)于廣西北京同仁堂藥店，經(jīng)筆者鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]的干燥全草，粉碎成粗粉，備用。

1.2 儀器

三源超聲波清洗器(東莞三源超聲波設(shè)備有限公司)；UV-2550島津-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；pH計(jì)(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 試劑

富馬酸(北京百靈威科技有限公司)，分析純?cè)噭?。其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[3]

精密稱取10 mg 富馬酸，加60%乙醇使溶解，定容到25 mL量瓶中，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密稱取草珊瑚粉末0.500 g，置具塞錐形瓶中，加60%乙醇20 mL，密塞，混勻，80 ℃ 500 W超聲30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL 置10 mL 量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，作為樣品溶液。

分別取對(duì)照品溶液和樣品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，配制成不同濃度的對(duì)照品溶液，依次加乙醇2 mL、0.08 mol·L-1鹽酸羥胺溶液1 mL、0.04 mol·L-1DCC (N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺)溶液1 mL，搖勻，60 ℃水浴15 min，加0.04 mol·L-1高氯酸鐵溶液1 mL，加乙醇至刻度，搖勻，在200～700 nm范圍進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，富馬酸與草珊瑚吸收光譜圖相似，在520 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。

分別取對(duì)照品溶液1～6 mL置10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，于520 nm處吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程式y(tǒng)= 0.004 5x+0.009 9(r= 0.999 2)，結(jié)果表明，富馬酸在40～240 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 提取方法的選擇

取0.5 g草珊瑚粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10倍量水，密塞，按表1方法提取，濾過(guò)，濾液置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，在60 min內(nèi)按2.1方法測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度與物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，吸光度越大，濃度越高，提取效果越好，結(jié)果表明，超聲提取法的吸光度最大，故選擇為本文的提取方法。

表1 提取方法對(duì)吸光度的影響

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

取0.5 g草珊瑚粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加堿水10 mL，超聲提取，濾過(guò)，濾液用稀HCl調(diào)pH，靜置，濾過(guò)，用水溶解沉淀，定容于10 mL量瓶中，測(cè)定吸光度，依次考察堿種類、堿水濃度、堿水pH值、沉淀pH值、提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)草珊瑚中酚酸類成分提取效果的影響。結(jié)果表明，堿種類以NaOH最好，堿水濃度以1.0 mol·L-1最好，堿水pH以10最好，沉淀pH值以4最好，提取時(shí)間越長(zhǎng)越好，提取溫度60℃以最好，料液比越高越好，如圖1～7。

圖1 堿種類-吸光度變化

圖2 堿水濃度-吸光度變化

圖3 堿水pH-吸光度變化

圖4 沉淀pH值-吸光度變化

圖5 提取時(shí)間-吸光度變化

圖6 提取溫度-吸光度變化

圖7 料液比-吸光度變化

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不考慮各因素之間的交互作用，選取堿水pH值、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素3水平，進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟同單因素實(shí)驗(yàn)，用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。由極差分析可知，影響提取率的因素排列順序?yàn)锽>D>A>C，即堿水pH值>提取溫度>提取時(shí)間>料液比。方差分析表明，堿水pH值和提取溫度對(duì)提取率的影響有顯著性(P<0.05)，而提取時(shí)間和提取溫度對(duì)提取率的影響無(wú)顯著性(P>0.05)。綜合考慮能源消耗、工藝成本、原料價(jià)格、提取效果等方面因素，確定最佳提取條件為A1B2C3D2，即提取時(shí)間為30 min，堿水pH值為10，料液比為1∶10，提取溫度為60 ℃，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)直觀分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

取對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定吸光度5次，考察精密度，結(jié)果為A=0.865±0.079，RSD=0.12%。取對(duì)照品溶液于0～120 min測(cè)定吸光度5次，考察穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果為A=0.866±0.083，RSD=0.07%。取0.5 g草珊瑚粉末，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按優(yōu)選工藝提取，測(cè)定吸光度，考察重復(fù)性，結(jié)果為A=0.861±0. 096，RSD=0.95%，表明本方法在120 min內(nèi)精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

2.6 堿水提取法與水提法的比較

取0.5 g草珊瑚粉末，精密稱定，分別以pH=10的堿水和水為溶劑，按優(yōu)選工藝提取，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中酚酸類成分的含量。堿水提取法樣品中酚酸類成分含量0.393±0.025，RSD=0.86%，n=3；水提取法樣品中酚酸類成分含量為0.360±0.026，RSD=1.61%，n=3；用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，按α=0.025水準(zhǔn)，當(dāng)t≥3.495時(shí)，接受原假設(shè)，兩種提取方法所得酚酸類成分含量有顯著性差異，即堿水提取法優(yōu)于水提法，見(jiàn)表4。

表4 兩種方法提取效果的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析

3 討 論

超聲波具有剪切作用和沖擊波能，使植物細(xì)胞璧破碎或變形，細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分容易滲出，堿能與酚酸類成分結(jié)合生成鹽，提高酚酸類成分從細(xì)胞內(nèi)滲出的速度和滲出量，從而提高提取效率，通過(guò)酸化作用，使酚酸類成分游離出來(lái)，去除大部分的雜質(zhì)，所得產(chǎn)品純度更高。本文采用堿水-超聲波法提取草珊瑚中酚酸類成分，工藝穩(wěn)定，提取率提高，雜質(zhì)減少，操作簡(jiǎn)單、速度快。

按文獻(xiàn)[3]的顯色方法，依次加入0.106 87 mol·L-1的高氯酸羥胺溶液1.10 mL、0.16 mol·L-1的DCC溶液0.15 mL，震蕩搖勻，室溫放置15 min，加0.102 mol·L-1酸性高氯酸鐵溶液，顯色效果不佳，并且實(shí)驗(yàn)室水平制備高氯酸羥胺具有一定的危險(xiǎn)性，因此，本文參照文獻(xiàn)[4-5]，并作適當(dāng)調(diào)整，使用0.08 mol·L-1的鹽酸羥胺溶液與0.04 mol·L-1的DCC溶液各1 mL，充分混合，60 ℃水浴15 min，加0.04 mol·L-1高氯酸鐵溶液1 mL，顯色效果良好，富馬酸濃度與吸光度線性關(guān)系良好，本方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均達(dá)到要求。