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(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京102488；2. 北京師范大學(xué)良鄉(xiāng)附屬中學(xué)，北京102488；3. 北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京100083)

艾納香[Blumeabalsamifera(L.) DC.]為菊科多年生植物，其葉片和嫩枝是提取艾片(左旋龍腦)的原料[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，艾片有抗炎鎮(zhèn)痛、抗茵、抗病毒、保護(hù)心腦、雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、提高其他藥物生物利用等作用[2]，并且其解熱持續(xù)作用及持續(xù)強(qiáng)度大于天然冰片及合成冰片[3]。新鮮或干燥地上部分也作藥用，具有溫中止瀉、活血解毒、祛風(fēng)除濕功能[4]，在臨床上的應(yīng)用極為廣泛。

目前，左旋龍腦的提取工藝較為成熟，但是其在艾納香葉片和嫩枝中的含量較低，范圍在0.015%～0.220%[5]，嚴(yán)重制約了艾納香產(chǎn)業(yè)升級(jí)，選育出高含量的優(yōu)良品種是其產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。另一方面，多倍體植物具有器官“巨大性”，并且其營(yíng)養(yǎng)成分及內(nèi)源物質(zhì)含量含量增加[6]。因此，培育四倍體植物新品種是中藥材豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的有效途徑之一，特別是對(duì)于以單體化合物提取的某些藥用植物而言意義重大。

前人對(duì)艾納香的化學(xué)組成及提取工藝研究較多，如王秋萍等建立HPLC-RID同時(shí)測(cè)定艾納香葉中左旋樟腦、左旋龍腦及異龍腦含量的方法[7]；吳麗芬等人研究出建立GC法測(cè)定艾納香油中β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯5個(gè)成分的含量[8]。本課題組以艾納香植株不同部位葉片和莖為材料，系統(tǒng)開(kāi)展了總黃酮提取工藝優(yōu)化方法研究，并確定了總黃酮含量測(cè)定的方法[9]。到目前為止，仍未見(jiàn)四倍體艾納香誘導(dǎo)及倍性鑒定的研究報(bào)道。本研究應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，采用秋水仙素誘導(dǎo)艾納香組培苗，產(chǎn)生變異體并對(duì)其進(jìn)行倍性鑒定為研究?jī)?nèi)容，研究結(jié)果為艾納香新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年4月，艾納香一年生苗取自貴州羅甸，種植于北京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園。2013年5月，取艾納香植株莖尖，經(jīng)過(guò)75%乙醇30 s及0.1%升汞5 min消毒處理后，再用無(wú)菌水沖洗3次，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 %+NAA 1.5 %+蔗糖3% +瓊脂1%(pH5.8)上誘導(dǎo)并繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件: 溫度(25±2) ℃，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，光照時(shí)間14 h/d。繼代培養(yǎng)出的艾納香組培苗應(yīng)用于本研究。

1.2 方法

觀察艾納香組培苗生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，確定組培苗分裂旺盛期范圍，繪制Logistic生長(zhǎng)曲線。采用浸泡法和混合培養(yǎng)兩種方法進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，每種方法均設(shè)置若干組處理時(shí)間和濃度梯度，研究不同秋水仙素濃度及處理時(shí)間對(duì)誘變率的影響。

1.2.1 Logistic生長(zhǎng)曲線

選取(0.2±0.02) g的艾納香莖尖組織，在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每天取出稱重，算出每天的增重量(g)，繪出Logistic生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 秋水仙素誘導(dǎo)

浸泡法：在組培苗繼代培養(yǎng)7 d后，挑選生長(zhǎng)一致、莖節(jié)粗壯的組培苗，切成長(zhǎng)1～2 cm的帶節(jié)莖段，放入經(jīng)過(guò)高壓滅菌濃度為0.04%、0.06%、0.08%的秋水仙素溶液中，分別浸泡6 h、12 h、18 h，以無(wú)菌水浸泡為對(duì)照。將各處理后的材料用無(wú)菌水沖3遍后，培養(yǎng)在繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后及下一代進(jìn)行死亡率和變異率調(diào)查。

混合培養(yǎng)法：在組培苗繼代培養(yǎng)7 d后，選取生長(zhǎng)一致、莖節(jié)粗壯的組培苗，切成長(zhǎng)1～2 cm的帶節(jié)莖段，接種到分別添加0.015%、0.025%、0.035%秋水仙素溶液的繼代培養(yǎng)基上，分別經(jīng)過(guò)5 d、7 d、9 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后，將處理后的材料轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后及下一代進(jìn)行死亡率和變異率調(diào)查。

1.2.3 形態(tài)學(xué)考察

以二倍體為參照，對(duì)變異植株從形態(tài)學(xué)進(jìn)行考察，包括株高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉厚、莖粗等指標(biāo)。

1.2.4 細(xì)胞學(xué)考察

上午9:00～10:00取全展葉片，用水保濕，用鑷子撕取葉片下表皮制片，用OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡觀測(cè)氣孔及其保衛(wèi)細(xì)胞的大小，并計(jì)算氣孔密度。

1.2.5 細(xì)胞中DNA含量檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞中DNA含量，參考周玉麗等[10]和張虹等[11]的方法。將艾納香嫩葉在盛有3 mL提取緩沖液的培養(yǎng)皿中剪碎，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心漂洗3次。制備的核懸液離心后棄去上層液體，加入2 mL染色緩沖液，暗處低溫下染色10 min，500目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液用標(biāo)準(zhǔn)試管收集，隨即上機(jī)測(cè)定。提取緩沖液成分：15 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，80 mol/L KCl，20 mol/L NaCl，20 mol/L EDTA-Na2，15 mol/L 巰基乙醇，0.05%的 TritionX-100。染色緩沖液為提取緩沖液內(nèi)加入20 mg/L RNA酶A和20 mg/L碘化丙啶。

2 結(jié)果與分析

2.1 Logistic生長(zhǎng)曲線

艾納香組培苗Logistic生長(zhǎng)曲線如圖1所示。圖1表明，在接種第7 d時(shí)增重量最大，此時(shí)為植株細(xì)胞分裂旺盛期，故選擇接種7 d左右的組培苗作為秋水仙素誘導(dǎo)的材料。

圖1 艾納香組培苗Logistic生長(zhǎng)曲線

2.2 不同秋水仙素處理方法對(duì)艾納香組培苗變異率的影響

以形態(tài)學(xué)和氣孔變異顯著作為變異的指標(biāo)，考察秋水仙素浸泡法和混合培養(yǎng)法對(duì)艾納香組培苗變異率的影響，結(jié)果如表1和表2所示。表1表明，在浸泡法處理中，秋水仙素濃度為0.06%、時(shí)間為12 h組合時(shí)，艾納香組培苗的變異率最高，達(dá)到36.7%，以及子二代變異率也最高(63.3%)。表2表明，在混合培養(yǎng)法處理中，秋水仙素濃度為0.025%、時(shí)間為9 d組合時(shí)，艾納香組培苗的變異率最高，達(dá)到65%，以及子二代變異率也較高(74.4%)。本研究結(jié)果表明，浸泡法和混合培養(yǎng)法均能有效的誘導(dǎo)艾納香植株發(fā)生變異，以混合培養(yǎng)法更適合艾納香植株誘變，其秋水仙素濃度為0.025%并處理7～9 d為宜。

表1 秋水仙素浸泡法對(duì)艾納香組培苗變異率的影響

表2 秋水仙素混合培養(yǎng)法對(duì)艾納香組培苗變異率的影響

2.3 形態(tài)學(xué)考察

與對(duì)照相比，經(jīng)過(guò)秋水仙素處理的艾納香變異植株的生長(zhǎng)較為緩慢，株高較二倍體矮小了40.5%，而葉長(zhǎng)、葉寬、葉厚及莖基部粗度較二倍體，分別顯著或極顯著增加了70.8%、96.5%、86.1%、53.8%(表3和圖2)。

表3 二倍體和四倍體艾納香組培苗的形態(tài)學(xué)比較

圖2 二倍體(左)四倍體(右)艾納香組培苗

2.4 細(xì)胞學(xué)考察

細(xì)胞學(xué)考察表明，四倍體艾納香植株葉片氣孔長(zhǎng)徑、短徑以及保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)和寬，均較二倍體差異顯著或極顯著(表4)。表4表明，二倍體艾納香植株葉片氣孔為63.3 μm × 42.4 μm，而四倍體則為84.9 μm ×50.3 μm，極顯著或顯著增加34.1%和18.6%。同樣，四倍體艾納香植株葉片的保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)和寬，較二倍體分別顯著增加49.6%和47.1%。四倍體艾納香植株葉片氣孔密度為6.0個(gè)/mm2，極顯著低于二倍體(6.0個(gè)/mm2)。

表4 二倍體和四倍體艾納香組培苗的氣孔及其保衛(wèi)細(xì)胞比較

2.5 細(xì)胞DNA含量檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖3表明，直方圖的縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)(表示的是細(xì)胞的相對(duì)數(shù))，橫坐標(biāo)為道數(shù)(Channel No.)，實(shí)質(zhì)上是所測(cè)的熒光的強(qiáng)度。二倍體植株僅在相對(duì)熒光強(qiáng)度值為256的位置上出現(xiàn)1個(gè)單峰(圖3左)，而四倍體植株在約在512的位置上出現(xiàn)1個(gè)單峰(圖3右)，后者為前者的 2 倍，這表明四倍體植株細(xì)胞中的DNA 含量也相應(yīng)增加了一倍，表明四倍體細(xì)胞中DNA含量已倍增，說(shuō)明秋水仙素誘導(dǎo)四倍體艾納香植株獲得了成功。

圖3 二倍體(左)和四倍體(右)艾納香組培苗葉片細(xì)胞中DNA含量

3 討 論

艾納香組培苗進(jìn)行Logistic生長(zhǎng)曲線表明，組培苗細(xì)胞的旺盛分裂期約在繼代培養(yǎng)第6～8 d，故在此期誘導(dǎo)能夠提高誘變成功率，這是本研究后續(xù)誘變成功的關(guān)鍵。

四倍體誘導(dǎo)率因秋水仙素濃度和處理時(shí)間不同而差異顯著。在本研究中，混合培養(yǎng)法在 0.015%～0.025%濃度范圍內(nèi)，均表現(xiàn)出多倍體誘導(dǎo)率隨處理時(shí)間的增加而升高，但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)點(diǎn)都會(huì)受到嚴(yán)重傷害，組培苗的存活率降低；當(dāng)濃度大于0.025%時(shí)，多倍體誘導(dǎo)率隨處理時(shí)間的增加而降低且死亡率顯著升高。在浸泡法中，秋水仙素的濃度變化對(duì)植株影響不如混培法明顯，但是處理時(shí)間對(duì)植株的死亡率影響也很大，并且其誘變率明顯低于混合培養(yǎng)法。本研究認(rèn)為，與浸泡法相比，混合培養(yǎng)法更適合四倍體艾納香誘導(dǎo)。

秋水仙素誘導(dǎo)的變異株表現(xiàn)為葉色變綠，葉片變大、變厚，莖段變粗等。同時(shí)，其氣孔大小及密度均與二倍體有顯著差異，這與相關(guān)研究報(bào)道相一致[12]。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)上的顯著差異進(jìn)行多倍體初步篩選，再結(jié)合細(xì)胞中DNA含量及染色體數(shù)目檢測(cè)是確定其倍性的有效方法。

本研究建立了誘導(dǎo)同源四倍體艾納香的方法，通過(guò)繼代培養(yǎng)獲得了更多的四倍體無(wú)菌苗，現(xiàn)正在進(jìn)行煉苗移栽，下一步進(jìn)行田間觀察與測(cè)試，期望篩選出藥用成分含量高、豐產(chǎn)且抗逆性好的優(yōu)良品種。