曹 興，張秀省，高祥斌，義鳴放，呂福堂*

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252059；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉，具有重要的觀賞、食藥用價(jià)值。百合多數(shù)喜微酸性土壤，土壤高鹽分會(huì)抑制百合的生長(zhǎng)發(fā)育，降低切花的產(chǎn)量和質(zhì)量，并造成種球退化。因此，解析百合的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制，鑒定調(diào)控耐鹽性的關(guān)鍵基因，對(duì)于采用基因工程技術(shù)來(lái)提高百合的耐鹽性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

作為植物體中普遍存在的第二信使，Ca2+參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和多種逆境脅迫響應(yīng)。植物感受外界刺激后，細(xì)胞中的Ca2+濃度在時(shí)空上出現(xiàn)特異性的變化，這種變化會(huì)被相應(yīng)的Ca2+感受器所感知，進(jìn)一步將信號(hào)傳遞給下游的靶蛋白，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)來(lái)響應(yīng)逆境脅迫。目前，植物中發(fā)現(xiàn)的Ca2+受體蛋白主要分為三類：鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM) 、類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like proteins，CBL)和鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)[1]。其中，CBL僅存在于高等植物中，與其下游靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase) 組成CBL-CIPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。到目前為止擬南芥中鑒定了10個(gè)CBL基因和25個(gè)CIPK基因，CBL1、CBL4、CBL10都能與CIPK24互作提高擬南芥的耐鹽性[2-4]。

本研究以麝香百合雜種系(L.longiflorumHybrids)品種‘白天堂’(‘White Heaven’)為試驗(yàn)材料，從中克隆了CBL基因，分析了百合CBL蛋白特性及CBL基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步研究CBL基因在百合耐鹽性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為麝香百合雜種系品種‘白天堂’(L.longiflorumcv. ‘White Heaven’)組培苗，培養(yǎng)條件為22 ℃，光照時(shí)間為16 h/d。亞細(xì)胞定位使用的材料為紫皮洋蔥(Alliumcepa)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，試驗(yàn)所用引物見表1。DNA測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 百合CBL基因的克隆 取百合葉片用液氮研磨，根據(jù)天根公司多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA。cDNA的合成根據(jù)Takara公司的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)說(shuō)明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄接頭引物為AP。

(1)LlCBL1基因的克隆。基因5′端序列的克?。喊凑誘aKaRa公司5′-Full RACE kit說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前獲得的百合CBL1基因片段設(shè)計(jì)兩條下游特異引物SPR1和SPR2，與試劑盒自帶的兩條5′端接頭引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第一輪引物為5′RACE Outer primer和SPR1，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取第一輪產(chǎn)物1 μL進(jìn)行第二輪反應(yīng)，引物為5′ RACE Inner primer和SPR2，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)序列的校正：將已經(jīng)獲得的目的基因片段用DNAMAN 5軟件拼接，并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上預(yù)測(cè)其ORF，根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計(jì)上游特異引物SPF1和下游特異引物SPR3，用保真性較高的PrimeSTAR?HS DNA Polymerase擴(kuò)增目的基因的ORF序列。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收，連接到pUM-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，Amp抗性培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將含有目的基因片段的陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

(2)LlCBL3基因的克隆。根據(jù)NCBI上已報(bào)道的擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCBL3的mRNA序列，利用BLAST程序搜索與其高度相似的百合表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag,EST)。然后將該序列在NCBI上進(jìn)行同源比對(duì)，用ORF Finder程序預(yù)測(cè)其ORF。在起始密碼子上游設(shè)計(jì)特異引物SPF2(上游)，在終止密碼子下游設(shè)計(jì)特異引物SPR4(下游)，使用PrimeSTAR?HS DNA聚合酶進(jìn)行ORF全長(zhǎng)校正，PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 LlCBL1與LlCBL3的生物信息學(xué)分析 用Primer Premier 5軟件將目的基因的ORF序列翻譯成氨基酸序列；用EXPASY (https://www.expasy.org/tools/)中的ProtParam、SMART、SignalP、TMHMM、PSORT、NetPhos，PSMP(http://plantsp.genomics.purdue.edu/myrist.html)等在線工具對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析；用DNAMAN 5對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析；用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 LlCBL1與LlCBL3的亞細(xì)胞定位 利用DNAMAN 5分析LlCBL1 ORF序列的酶切位點(diǎn)，結(jié)合pSAT6-GFP載體，選用HindⅢ和PstI作為融合表達(dá)載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)上游特異引物SPF3和下游特異引物SPR5進(jìn)行PCR擴(kuò)增。雙酶切pSAT6-GFP空載質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接，獲得pSAT6-LlCBL1-GFP重組表達(dá)載體，雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證連接是否成功。用同樣的方法構(gòu)建pSAT6-LlCBL3-GFP重組表達(dá)載體，選用的限制性內(nèi)切酶為HindⅢ和PstI，設(shè)計(jì)的特異引物為SPF4(上游)和SPR6(下游)。用基因槍轟擊法[5]將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轟擊到在MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24 h的洋蔥表皮細(xì)胞中，暗培養(yǎng)24 h后用激光共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)觀察和拍照，并用EZ-C1軟件對(duì)照片進(jìn)行分析和處理。

1.2.4LlCBL1與LlCBL3的表達(dá)分析 選擇生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的‘白天堂’組培苗作為基因表達(dá)分析的材料。

LlCBL1、LlCBL3在不同組織中的表達(dá)：分別取常溫(22 ℃)培養(yǎng)的百合組培苗的根、鱗莖和葉片。

LlCBL1、LlCBL3在鹽脅迫下的表達(dá)：常溫(22 ℃)下，用20 mL 100 mmol/L NaCl溶液浸沒(méi)百合組培苗根系，分別在處理0、1、3、6和12 h取葉片。

所取組織用液氮速凍并保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用提取RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的方法檢測(cè)基因的表達(dá)，LlCBL1的擴(kuò)增引物為qF1和qR1，LlCBL3的擴(kuò)增引物為qF2和qR2，內(nèi)參基因18S rRNA的擴(kuò)增引物為18SqF和18SqR。實(shí)驗(yàn)參照Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTMkit熒光定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，儀器為Applied Biosystems Prism 7300 PCR儀。采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用2-ΔΔCT方法[6]分析基因的相對(duì)表達(dá)量，用Excel軟件分析數(shù)據(jù)。

表1 PCR引物

表中下劃線表示酶切位點(diǎn)

Underline represents enzyme cleavage site

2 結(jié)果與分析

2.1 百合LlCBL1與LlCBL3基因的克隆

將獲得的目的基因在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，分別定名為L(zhǎng)lCBL1(GenBank登錄號(hào)JQ911694)和LlCBL3(GenBank登錄號(hào)JQ713001)。其中，LlCBL1基因ORF區(qū)序列長(zhǎng)為642 bp，編碼213個(gè)氨基酸(圖1，a)；LlCBL3基因ORF區(qū)序列長(zhǎng)為672 bp，編碼223個(gè)氨基酸(圖1，b)。

a.LlCBL1開放閱讀框及編碼的氨基酸序列;b.LlCBL3開放閱讀框及編碼的氨基酸序列a.The open reading frame of LlCBL1 and the predicted amino acid sequences;b.The open reading frame of LlCBL3 and the predicted amino acid sequences圖1 百合CBL基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列Fig.1 The open reading frame of lily CBL genes and the predicted amino acid sequences

2.2 百合LlCBL1與LlCBL3的生物信息學(xué)分析

ProtParam在線工具預(yù)測(cè)百合LlCBL1蛋白包含213個(gè)氨基酸殘基，分子式為C1102H1709N279O334S6，分子量為24.41 ku，屬于穩(wěn)定蛋白、親水性蛋白和酸性蛋白。LlCBL3蛋白包含223個(gè)氨基酸殘基，分子式為C1162H1806N294O349S6，分子量為25.67 ku，屬于不穩(wěn)定蛋白、親水性蛋白和酸性蛋白。蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)程序SignalP預(yù)測(cè)LlCBL1和LlCBL3均不含信號(hào)肽，蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)軟件TMHMM未發(fā)現(xiàn)LlCBL1和LlCBL3有明顯的跨膜區(qū)域，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位工具PSORT預(yù)測(cè)LlCBL1主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)，LlCBL3主要定位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體內(nèi)。

蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具NetPhos預(yù)測(cè)LlCBL1含有13個(gè)絲氨酸(Ser)、5個(gè)蘇氨酸(Thr)及1個(gè)酪氨酸(Tyr)潛在磷酸化位點(diǎn)，LlCBL3含有12個(gè)絲氨酸(Ser)、7個(gè)蘇氨酸(Thr)潛在磷酸化位點(diǎn)，這些潛在的磷酸化位點(diǎn)可能是CBL活性和功能調(diào)控所必需的。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具SMART預(yù)測(cè)LlCBL1和LlCBL3均含有4個(gè)EF手型基序(EF-hand motif)(圖2)。EF手型結(jié)構(gòu)域是CBL的特征結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合Ca2+，使得CBL能夠解碼環(huán)境Ca2+信號(hào)。與百合鈣調(diào)蛋白LlCaM3[7]的典型EF手(canonical EF-hand)相比，LlCBL1的EF1和EF2的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了取代，導(dǎo)致Ca2+結(jié)合活性降低甚至不能結(jié)合Ca2+，這些稱為非典型EF手(noncanonical EF-hand)，因此LlCBL1含有2個(gè)典型EF手型基序和2個(gè)非典型EF手型基序。與LlCaM1相比，LlCBL3的4個(gè)EF手均為非典型EF手型基序。LlCBL1和LlCBL3的C端含有1個(gè)保守的PFPF基序(PFPF motif)，在該結(jié)構(gòu)域中被苯丙氨酸-脯氨酸殘基(Phe-Pro)和Phe殘基包圍的Ser殘基是CIPK磷酸化作用的靶點(diǎn)(圖2)。與LlCBL3相比，蛋白質(zhì)豆蔻?；A(yù)測(cè)工具PSMP在LlCBL1的N端發(fā)現(xiàn)了1個(gè)豆蔻?；?N-Myristoylation motif)(圖2)，該基序可能在LlCBL1的蛋白互作和膜錨定過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Ll:百合Lilium longiflorum;LlCBL1:AFU36090;LlCBL3:AFI41211;LlCaM3:AFA89863圖2 百合CBL與CaM氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of LlCBL1,LlCBL3 and LlCaM3

圖中各節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表可信度。Eg:油棕;Pd:海棗;Ao:石刁柏;Ll:百合;Os:水稻;Ta:小麥;Vv:葡萄;At:擬南芥The numbers at the node of the figure is credibility.Eg:Elaeis guineensis;Pd:Phoenix dactylifera;Ao:Asparagus officinalis;Ll:Lilium longiflorum;Os:Oryza sativa;Ta:Triticum aestivum;Vv:Vitis vinifera;At:Arabidopsis thaliana圖3 百合LlCBL1、LlCBL3與其他植物CBL家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic relationship of LlCBL1，LlCBL3 with other plant CBLs

將百合LlCBL1及與其同源性較高的其他植物的CBL1、LlCBL3及與其同源性較高的其他植物的CBL3、擬南芥AtCBL1-AtCBL10的氨基酸序列，用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示CBL家族可分為兩個(gè)亞族：第Ⅰ亞族包括CBL1、CBL4、CBL5、CBL8、CBL9；CBL2、CBL3、CBL6、CBL7、CBL10歸屬第Ⅱ亞族。百合LlCBL1與同為單子葉植物的油棕(Elaeisguineensis)EgCBL1、海棗(Phoenixdactylifera)PdCBL1的親緣關(guān)系最近(圖3)，相似度達(dá)92%。百合LlCBL3與同為百合科的石刁柏(Asparagusofficinalis)AoCBL3的親緣關(guān)系最近(圖3)，相似度達(dá)92%。特征結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明本研究分離得到的LlCBL1和LlCBL3基因分別屬于植物CBL1和CBL3的同源基因。

2.3 百合LlCBL1與LlCBL3亞細(xì)胞定位

利用基因槍將構(gòu)建好的瞬時(shí)表達(dá)載體pSAT6-LlCBL1-GFP和pSAT6-LlCBL3-GFP轟擊到經(jīng)過(guò)24 h預(yù)培養(yǎng)的洋蔥表皮細(xì)胞中，暗培養(yǎng)24 h后放置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，空載對(duì)照pSAT6-GFP的熒光信號(hào)分布在整個(gè)細(xì)胞中，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中也檢測(cè)到了pSAT6-LlCBL3-GFP的熒光信號(hào)，而pSAT6-LlCBL1-GFP的熒光信號(hào)僅在細(xì)胞膜中檢測(cè)到(圖4)。表明LlCBL3在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，LlCBL1在細(xì)胞膜中表達(dá)。

2.4 百合LlCBL1與LlCBL3的表達(dá)分析

利用qPCR檢測(cè)了LlCBL1與LlCBL3的時(shí)空表達(dá)。結(jié)果表明，常溫(22 ℃)下，LlCBL1、LlCBL3在百合根、鱗莖和葉中均有表達(dá)，LlCBL1在根中的表達(dá)量最高，鱗莖中次之，葉中最低；LlCBL3在葉中的表達(dá)量最高，根中次之，鱗莖中最低(圖5，a)。在鹽脅迫處理1～12 h內(nèi)，百合葉片中LlCBL1的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，但始終高于對(duì)照，在處理6 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照的6.33倍(P<0.05)；百合葉片中LlCBL3的相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，但僅在1～3 h內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照(P<0.05)，鹽脅迫處理3 h的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的3.10倍(圖5，b)。

圖4 LlCBL1與LlCBL3在洋蔥表皮中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of LlCBL1 and LlCBL3 in onion epidermal cells

a.LlCBL1與LlCBL3在根、鱗莖、葉中的表達(dá)；b.葉片LlCBL1與LlCBL3在不同NaCl處理時(shí)間下的表達(dá),*表示各點(diǎn)與0 h的表達(dá)量在P<0.05水平差異顯著a.The expression of LlCBL1 and LlCBL3 in root,bulb and leaf;b.The expression of LlCBL1 and LlCBL3 in leaf treated with 100 mM NaCl at different time,*represent significant correlation at 0.05 level圖5 LlCBL1與LlCBL3時(shí)空表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of LlCBL1 and LlCBL3 in lily

3 討論

百合屬于鹽敏感性植物，我國(guó)北方地區(qū)土壤的鹽漬化阻礙了百合的種植及發(fā)展，因此培育耐鹽品種是百合育種的重要內(nèi)容。目前，有關(guān)百合的鹽脅迫研究主要集中在以下幾個(gè)方面：(1)百合對(duì)鹽脅迫的形態(tài)及生理響應(yīng)[8-9]。(2)百合種質(zhì)耐鹽性比較[10-11]。(3)利用化學(xué)、微生物或雜交育種的方法提高百合的耐鹽性[12-15]。除常規(guī)雜交育種外，百合耐鹽轉(zhuǎn)基因育種也取得了初步進(jìn)展。鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)JERF3基因的百合小鱗莖的發(fā)芽率顯著高于野生型，死亡率顯著低于野生型，表明轉(zhuǎn)基因百合的耐鹽性能明顯提高[16]。將6-磷酸山梨醇脫氫酶(S6PDH)基因?qū)膑晗惆俸?，鹽脅迫下轉(zhuǎn)化植株的電導(dǎo)率和MDA含量均小于對(duì)照，可溶性蛋白含量高于對(duì)照，且具有比對(duì)照更高的酶活性，說(shuō)明轉(zhuǎn)化苗的抗鹽性較強(qiáng)[17]。

對(duì)百合耐鹽功能基因的研究，除了上述的S6PDH、JERF3外，還包括APX[18]、LLA23[19]等，但對(duì)于在植物鹽脅迫響應(yīng)中起關(guān)鍵作用的CBL基因的研究尚未見報(bào)道。CBL通過(guò)與CIPK互作解碼特異鈣信號(hào)所組成的Ca2+-CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)是植物逆境信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵途徑，在植物的耐鹽性調(diào)控中發(fā)揮重要作用[20]。CBL為多基因家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)擬南芥、水稻、玉米和楊樹CBL家族均含有10個(gè)成員，本研究從百合中分離鑒定了LlCBL1和LlCBL3基因，還分離鑒定了LlCBL2與LlCBL4(未發(fā)表)，百合的基因組較大，推測(cè)百合中還存在其他CBL基因。CBL蛋白主要由N端和C端兩個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域均含有一對(duì)EF手型基序，每個(gè)EF手型基序由12個(gè)氨基酸殘基組成。與CaM的典型EF手型基序的氨基酸序列(DXD(N)XD(N)(S)GXI(V)D(N)(S)XXE)相比，CBL的EF手型結(jié)構(gòu)存在不同程度的變異，如擬南芥CBL家族的10個(gè)成員中，AtCBL1和AtCBL9有2個(gè)典型EF手型基序，AtCBL6、AtCBL7、AtCBL8和AtCBL10只含有一個(gè)典型EF手型基序，而AtCBL2、AtCBL3、AtCBL4和AtCBL5則沒(méi)有典型EF手型基序[1]。百合LlCBL1和LlCBL3的EF手型基序的部分關(guān)鍵位點(diǎn)也發(fā)生了氨基酸取代，LlCBL1含有2個(gè)典型EF手型基序和2個(gè)非典型EF手型基序，LlCBL3的4個(gè)EF手型基序均為非典型EF手型基序。EF手型基序中氨基酸序列的變化導(dǎo)致CBL具有不同的Ca2+結(jié)合活性，可能解碼來(lái)自不同環(huán)境脅迫的Ca2+信號(hào)。在LlCBL1和LlCBL3的C端含有保守的PFPF基序，其中P、M、L、F、P和F氨基酸殘基完全保守，位于P與F之間的S殘基是CIPK磷酸化作用的靶點(diǎn)，這一磷酸化機(jī)制能夠促進(jìn)CBL與CIPK互作，并參與對(duì)下游靶蛋白活性的調(diào)控，是CBL-CIPK信號(hào)途徑的重要調(diào)控機(jī)制之一[21]。根據(jù)N端的結(jié)構(gòu)，CBL可以分為兩個(gè)亞族，第Ⅰ亞族的N端具有高度保守的豆蔻?；Ｐ騇GCXXSK/T，豆蔻?；堑鞍踪|(zhì)翻譯后修飾的一種方式，在蛋白互作和膜定位方面發(fā)揮作用。在MGCXXSK/T模序中，豆蔻?；饔冒l(fā)生在蛋氨酸后的甘氨酸殘基，發(fā)生豆蔻?；饔玫腃BL蛋白具有較低的膜定位活性，但當(dāng)甘氨酸后面的半胱氨酸殘基發(fā)生棕櫚?；螅湍軐⒌鞍锥ㄎ辉诩?xì)胞膜上[22]。在LlCBL1的N端發(fā)現(xiàn)了1個(gè)豆蔻?；颍瑏喖?xì)胞定位的結(jié)果證實(shí)了LlCBL1主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，這與對(duì)同屬第Ⅰ亞族AtCBL1和AtCBL9的研究結(jié)果類似[20]。第Ⅱ亞族的N端較長(zhǎng)，缺少豆蔻?；?、棕櫚?；戎|(zhì)修飾位點(diǎn)。LlCBL3歸屬于第Ⅱ亞族，亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明LlCBL3在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，這與同屬第Ⅱ亞族的AtCBL3在細(xì)胞膜和液泡膜上表達(dá)的結(jié)果不同[20]。同屬第Ⅱ亞族的AtCBL2和AtCBL6定位于液泡膜上，AtCBL10定位在細(xì)胞膜和液泡膜上，AtCBL7在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)[20]。這些多樣而特異的亞細(xì)胞定位暗示CBL作為鈣感受器能夠快速傳遞局部鈣釋放事件。

在植物進(jìn)化過(guò)程中，CBLs和CIPKs基因數(shù)量的增加很可能與CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)的功能進(jìn)化相關(guān)，這有利于時(shí)空特異性Ca2+信號(hào)的識(shí)別與解碼，暗示CBL和CIPK進(jìn)化的復(fù)雜性與植物的環(huán)境適應(yīng)性相一致[23]。擬南芥可以通過(guò)CBL4-CIPK24-SOS1通路[3]或CBL10-CIPK24-NHX通路[4]來(lái)提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受性。過(guò)表達(dá)玉米ZmCBL9、煙草NsylCBL10或楊樹PeCBL6提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[24-26]。AtCBL1通過(guò)互作將AtCIPK24帶至細(xì)胞膜參與鹽脅迫反應(yīng)，AtCBL1還可以與AtCIPK23互作調(diào)控AKT1介導(dǎo)的根細(xì)胞K+的吸收與運(yùn)輸，AtCBL1還參與了干旱脅迫和冷脅迫應(yīng)答等[23]。沙冬青AmCBL1受鹽、干旱和CaCl2誘導(dǎo)表達(dá)，在煙草中過(guò)表達(dá)AmCBL1提高了植株的耐鹽性和耐旱性[27]。杜梨PbCBL1的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，PbCBL1的轉(zhuǎn)入可以提高大腸桿菌對(duì)鹽脅迫的耐受能力[28]。鹽脅迫顯著促進(jìn)了水稻OsCBL1、OsCBL3和楊樹PeCBL1、PeCBL3的表達(dá)[29-30]。本研究中，LlCBL1和LlCBL3的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，但二者的表達(dá)模式存在差異。LlCBL3在早期(1～3 h)響應(yīng)鹽脅迫，LlCBL1在1～12 h內(nèi)持續(xù)響應(yīng)鹽脅迫，且LlCBL1的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)顯著高于LlCBL3。

多基因家族、多樣而特異的表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位表明了CBL/CIPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性與功能的多樣性。課題組從百合中分離了兩個(gè)CBL家族基因LlCBL1和LlCBL3，研究了LlCBL1和LlCBL3的亞細(xì)胞定位和基因表達(dá)模式，結(jié)果表明LlCBL1可能與百合的鹽脅迫響應(yīng)密切相關(guān)，但是還需要進(jìn)一步在模式植物和百合上分析基因功能。本研究為探討百合CBL基因在百合耐鹽性調(diào)節(jié)方面的功能及作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。