郁征宇, 葛晨輝, 王小麗, 徐晨曦, 王全華, 蔡曉鋒

(上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

0 引 言

當(dāng)植物受到高溫、低溫、干旱和鹽等非生物脅迫時,其體內(nèi)會產(chǎn)生大量的O2-、HO-、過氧化氫(H2O2)等活性氧(ROS)[1].即使是在正常的條件下,植物體內(nèi)的許多代謝過程,包括葉綠體、線粒體和質(zhì)膜相關(guān)的電子傳遞系統(tǒng)也會釋放出活性氧[2].當(dāng)活性氧清除系統(tǒng)無法及時去除細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧時,就會造成植物細(xì)胞層面上的氧化損傷[3].植物細(xì)胞內(nèi)存在酶類和非酶類兩種清除活性氧的抗氧化系統(tǒng),其中抗氧化物酶類系統(tǒng)中包括了超氧化物歧化酶(SOD),抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)等,而對去除過氧化氫起主要作用的是CAT和APX,APX是抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)中的關(guān)鍵酶,對H2O2的親和力更強(qiáng)[4],以抗壞血酸(ASA)為電子供體,催化H2O2的還原[5].APX是保護(hù)葉綠體免受H2O2氧化損傷的主要酶類.有大量研究證實了APX在植物應(yīng)對非生物脅迫中起著重要作用.

APX主要存在于高等植物中,在某些真核藻類、藍(lán)細(xì)菌和昆蟲中也檢測到了APX[6].通過亞細(xì)胞定位研究,將APX同工酶分為4種類型:細(xì)胞質(zhì)型、葉綠體型、線粒體型和微體型[7].在擬南芥和水稻中都檢測到了8種APX同工酶,擬南芥APX有3個位于細(xì)胞質(zhì),2個位于葉綠體,另外3個位于過氧化物酶體中[8];水稻APX中的2個存在于細(xì)胞質(zhì),3個存在于葉綠體,2個存在于過氧化物酶體,另外1個結(jié)合在線粒體上[9].

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)為耐寒性蔬菜,含有豐富的營養(yǎng),生長溫度高于25 ℃時,其品質(zhì)和產(chǎn)量都會受到影響,嚴(yán)重時甚至死亡.高溫、干旱和鹽含量的急劇變化都會導(dǎo)致活性氧的大量累積,APX在清除活性氧中的關(guān)鍵作用使得探討菠菜APX基因的表達(dá)調(diào)控具有重要的理論意義和實踐價值.本文作者對菠菜APX進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析,并研究了其組織表達(dá)和環(huán)境脅迫調(diào)控能力.

1 材料與方法

1.1 菠菜APX基因的鑒定

在擬南芥種質(zhì)信息(TheArabidopsisInformation Resource,TAIR) 數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)中獲得擬南芥AtAPXs(Ascorbate Peroxidases)蛋白序列,在菠菜數(shù)據(jù)庫(http://www.spinachbase.org/?q=blast)中進(jìn)行TBLASTN分析得到菠菜APX基因候選序列,同時對所獲得的序列開放閱讀框(ORF),利用GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)預(yù)測確認(rèn).經(jīng)篩選后的氨基酸序列再利用ScanProsite軟件(http://www.expasy.ch/tools/seanprosite/)和InterProScan軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)來驗證是否含有APX基因保守序列.

1.2 基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守序列及進(jìn)化樹分析

利用基因核苷酸編碼序列與其相對應(yīng)的基因組序列,通過Gene Structure Display Server (GSDS 2.0,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)確定其基因結(jié)構(gòu).利用Protpi (https://www.protpi.ch/Calculator/ProteinTool#ProteinInputs)預(yù)測氨基酸數(shù)量、分子量和等電點.使用ClustalW進(jìn)行多重序列比對,MEGA5[10]繪制進(jìn)化樹(NJ tree).利用MEME suite (http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守基序(motif)分析,通過p-value判斷結(jié)果是否達(dá)到顯著水平.在線使用WoLF PSORT (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)對其蛋白質(zhì)序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位.

1.3 菠菜材料的處理與采樣

選取S104菠菜為實驗材料,將種子播種于穴盤,以體積比例為1∶1的草炭土/珍珠巖為基質(zhì),在玻璃溫室中育苗.選取長勢一致的幼苗,小心洗去根部基質(zhì),移至營養(yǎng)液(大量元素采用Hoagland配方,微量元素采用Arnon配方)中進(jìn)行水培,營養(yǎng)液每3 d進(jìn)行一次更換,并且每天對其pH值進(jìn)行測量與調(diào)節(jié),使其保持在5.8～6.0之間.水培菠菜置于人工氣候室中,光周期為10 h光照/14 h黑暗,溫度控制在21 ℃(光照)/18 ℃(黑暗),光照強(qiáng)度約為5000 lx,濕度控制在71%左右.水培兩周后,選取長勢一致的菠菜苗,準(zhǔn)備進(jìn)行環(huán)境脅迫處理.采用添加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PEG 4000的方式進(jìn)行干旱模擬;通過添加物質(zhì)的量濃度為400 mmol·L-1的NaCl溶液模擬鹽脅迫環(huán)境;噴施物質(zhì)的量濃度為100 mmol·L-1的H2O2模擬氧化脅迫;調(diào)節(jié)人工氣候箱的溫度模擬高溫脅迫(40 ℃)及低溫脅迫(4 ℃).分別在脅迫處理后的0,3,6,12 h時對菠菜功能葉進(jìn)行采樣.

選取長勢一致的幼苗定植于自然條件光照的玻璃溫室中.在菠菜植株開花期采集不同發(fā)育階段的根、莖、功能葉、功能葉葉柄、新葉、新葉葉柄、雄花和雌花樣品,并立即于-80 ℃液氮中冰凍保存.

1.4 APX基因表達(dá)分析

使用Trizol法提取菠菜總核糖核酸(RNA),并使用NanoDropTMOneC分析RNA的濃度與質(zhì)量.通過PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(Complementary DNA)模板.使用Primer-BLAST (https:www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)進(jìn)行引物設(shè)計.使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 試劑盒在ABI 7500上進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR).采用So18s基因作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量,用GraphPad Prism 7對結(jié)果進(jìn)行作圖.

2 結(jié) 果

2.1 菠菜SoAPXs家族成員全基因組鑒定

在菠菜基因組數(shù)據(jù)庫中利用8個擬南芥AtAPX蛋白序列進(jìn)行TBLASTN分析,經(jīng)過保守序列確認(rèn)得到7個菠菜SoAPXs基因,數(shù)量與擬南芥和水稻的8個相似.將這7個基因分別命名為SoAPX1,SoAPX2,SoAPX3,SoAPX4,SoAPX5,SoAPX6和SoAPX7.

菠菜SoAPXs基因的基因組核苷酸序列長度分布于755 bp(SoAPX7)到6688 bp(SoAPX2)之間.開放式閱讀框長度最短的是429 bp(SoAPX7),最長的為421 bp(SoAPX6),對應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量分布于142～421之間.蛋白質(zhì)相對分子量(MW)在1.554×104～4.572×104u之間,等電點(pI)最大為8.40(SoAPX6),最小為5.26(SoAPX7)(表1).亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示SoAPX1,SoAPX3和SoAPX7蛋白定位于細(xì)胞質(zhì);SoAPX2、SoAPX5和SoAPX6蛋白定位于細(xì)胞周質(zhì);SoAPX4則定位于細(xì)胞外基質(zhì).

表1 菠菜SoAPX家族基因信息

菠菜SoAPXs基因的外顯子數(shù)量為5～12個(圖1),其中SoAPX2,SoAPX3,SoAPX4和SoAPX5都含有9個外顯子,8個內(nèi)含子;SoAPX1含有8個外顯子,SoAPX6含有12個外顯子,SoAPX7含有5個外顯子.

圖1 菠菜SoAPX家族基因結(jié)構(gòu)

2.2 菠菜SoAPX家族蛋白保守基序分析

利用Pfam對擬南芥和菠菜APX蛋白序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示每個基因都含有過氧化物酶(peroxidase)的結(jié)構(gòu)域.MEME對菠菜和擬南芥共15個APX蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析,共鑒定了9個保守基序,長度在11～50個氨基酸殘基之間(圖2).

圖2 菠菜SoAPX基因中保守基序的氨基酸序列

這些motifs的分布如圖3所示:每個APX蛋白中的motif數(shù)量在4～9之間,其中motif 4存在于所有蛋白中,其次是motif 1和motif 7,存在于除SoAPX6外的其余14個蛋白中,其中motif 7都位于C末端,出現(xiàn)次數(shù)最少的是motif 8,在SoAPX1,SoAPX2,SoAPX3,SoAPX4,SoAPX5,AtAPX1,AtAPX2和AtAPX5中出現(xiàn),并且都位于N端.

圖3 菠菜與擬南芥APX蛋白保守基序分布

2.3 菠菜和其他植物APX蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

圖4 菠菜及其他3種植物的APX蛋白進(jìn)化樹分析

利用菠菜、擬南芥和水稻的APX蛋白質(zhì)長序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4).結(jié)果表明AtAPX4和AtAPX6未被聚類,其他APX被聚為4個大類:SoAPX1與定位于細(xì)胞質(zhì)的AtAPX1,AtAPX2,OsAPX1和OsAPX2為一類,SoAPX2,SoAPX3及SoAPX7與定位在過氧化物酶體上的AtAPX3,OsAPX3及OsAPX4聚為一類,SoAPX5和SoAPX4與定位在過氧化物酶體上的AtAPX5聚為一類,SoAPX6與定位于葉綠體上的AtSAPX,AtTAPX,OsAPX5,OsAPX8,以及OsAPX6,OsAPX7聚為一類.

2.4 菠菜SoAPX基因在各組織中的表達(dá)

利用菠菜的7個SoAPX基因特異引物(表2)進(jìn)行qRT-PCR檢測,表達(dá)結(jié)果表明菠菜SoAPXs基因在所使用檢測部位中均有表達(dá),除SoAPX2在根中表達(dá)較低外,其他6個基因在根中都有較高的表達(dá)(圖5).SoAPX7在各個組織中的表達(dá)較低,其次是SoAPX3.SoAPX7在雄花中表達(dá)最多,在功能葉、功能葉葉柄和莖中表達(dá)較低.SoAPX3主要在根、新葉和新葉葉柄中表達(dá),在功能葉中表達(dá)較低.SoAPX4和SoAPX5的組織表達(dá)模式類似,在根部表達(dá)最多,其次是功能葉、功能葉葉柄,在莖中表達(dá)較低,在新葉、新葉葉柄、雄花和雌花中幾乎不表達(dá).SoAPX1則與SoAPX3具有類似的表達(dá)模式,主要在新葉和新葉葉柄中表達(dá),其次是根,在功能葉中的表達(dá)較低.SoAPX6除了在根中表達(dá)較高外,在其他各組織中均有類似的表達(dá)量(圖5).

表2 菠菜APX基因qRT-PCR引物

圖5 SoAPX基因在菠菜不同組織中的表達(dá)分析.(a)～(g) SoAPX1～SoAPX7,R:根;S:莖;L:功能葉;P:功能葉柄;YL:新葉;YP:新葉葉柄;FF:雌花;MF:雄花

2.5 菠菜SoAPX基因在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)

圖6為菠菜SoAPX基因經(jīng)不同脅迫處理后的表達(dá)結(jié)果.由圖6可知,經(jīng)低溫脅迫處理6 h后,各SoAPX基因的表達(dá)都出現(xiàn)了不同程度的上調(diào),而在低溫脅迫12 h后,大部分基因的表達(dá)下調(diào).SoAPX3和SoAPX6在低溫脅迫時長為3 h時上調(diào),在時長為6 h和12 h時的表達(dá)則逐漸降低,特別當(dāng)時長為12 h時其表達(dá)相比對照存在明顯的下調(diào).SoAPX1,SoAPX2和SoAPX7在低溫脅迫時長為1,3,6 h時的表達(dá)呈上升趨勢,在6 h時表達(dá)量已達(dá)到對照的2.5倍,在處理12 h后的表達(dá)則下調(diào).

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圖6 菠菜SoAPX基因?qū)Σ煌h(huán)境脅迫的響應(yīng).(a)～(g) SoAPX1～SoAPX7

經(jīng)鹽脅迫處理后,在3 h時SoAPX3和SoAPX7的表達(dá)有明顯上升,表達(dá)量是對照的3.8倍和4.6倍,其他基因的表達(dá)也都有小幅的上調(diào).SoAPX3和SoAPX6的表達(dá)僅在3 h時有所上調(diào),其余處理時長的表達(dá)均下調(diào)表達(dá),并在12 h時達(dá)到最低.SoAPX5的表達(dá)在12 h時有小幅上調(diào),其他基因的表達(dá)在處理12 h后都被不同程度地抑制.

SoAPX6經(jīng)高溫脅迫處理后表達(dá)下調(diào).經(jīng)高溫脅迫12 h后,除SoAPX7外,其他基因的表達(dá)都明顯受到抑制,SoAPX3與SoAPX7類似,它們的表達(dá)均于高溫脅迫3 h后顯著上調(diào),在其他時長下基本都被抑制.

SoAPX7對干旱處理的響應(yīng)最為強(qiáng)烈,在處理3 h和12 h后其表達(dá)量分別上調(diào)到對照組的5.5倍和4.2倍.經(jīng)干旱處理1 h后,SoAPX1,SoAPX2,SoAPX3和SoAPX6的表達(dá)都被抑制,在處理3 h后都出現(xiàn)回升,隨后又呈下降趨勢.SoAPX4和SoAPX5在干旱處理下各個時長的表達(dá)相比對照組都有小幅上調(diào).

經(jīng)氧化脅迫3 h和6 h后,各SoAPX基因的表達(dá)都有所上調(diào),處理6 h后表達(dá)量的上調(diào)最為明顯,其中最明顯的是SoAPX1的表達(dá)量達(dá)到了對照組的5.2倍,其次是SoAPX4(4.9倍).

3 討 論

植物體內(nèi)含有多個APX蛋白的編碼基因,本研究在菠菜中發(fā)現(xiàn)的7個APX蛋白家族成員,在數(shù)量上與擬南芥(8個)、水稻(8個)以及玉米(9個)[11]相近.通過Blast比對發(fā)現(xiàn)篩選到的7個APX蛋白均與水稻和擬南芥相對應(yīng)的氨基酸序列有較高的同源性,這7個蛋白也與茶樹[12]以及白樺[13]的APX蛋白同源性較高,都含有過氧化物酶的保守結(jié)構(gòu)域.亞細(xì)胞定位預(yù)測到菠菜SoAPX蛋白的表達(dá)部位和與其同源的擬南芥、水稻APX并不完全相同,還有待進(jìn)一步實驗的驗證,然而由多部位的表達(dá)可以推測它的功能具有多樣性,可通過多重機(jī)制多細(xì)胞器配合清除細(xì)胞內(nèi)多余的活性氧,實現(xiàn)抗氧化功能.

植物APX基因家族在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等生理過程中都發(fā)揮著非常重要的作用.當(dāng)植物受到多種生物和非生物脅迫時,APX將通過調(diào)控植物的一系列生理生化過程,快速清除細(xì)胞中過量的H2O2,使細(xì)胞免受活性氧的毒害.本研究結(jié)果表明菠菜SoAPX6基因在各個組織均有表達(dá),與劉慧春[14]發(fā)現(xiàn)的紅掌AnAPX基因表達(dá)相似,由此推斷該基因在菠菜生長發(fā)育過程中發(fā)揮著多重作用.此外,紅掌AnAPX基因在根中表達(dá)最高,與本研究中除SoAPX2外的其他6種菠菜SoAPX基因表達(dá)類似.SoAPX2在根中的表達(dá)比葉中低很多,這與張蕾等[15]對毛白楊PcAPX進(jìn)行的組織表達(dá)分析結(jié)果相似,只是SoAPX2主要在新葉中表達(dá),而PcAPX主要在老葉中表達(dá).SoAPX1和SoAPX3的組織表達(dá)模式基本一致,由此推測兩者在植物體內(nèi)所發(fā)揮的作用相似.SoAPX7在雄花和雌花中相對較高的表達(dá)量,表明其可能在菠菜性器官的發(fā)育過程中起重要作用.

本研究中SoAPX3和SoAPX7在受鹽脅迫的過程中被誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果與王超等[13]SsAPX在鹽脅迫下的反應(yīng)一致,表明它們可能參與了菠菜抗鹽的生理反應(yīng),具有保護(hù)菠菜免受鹽脅迫造成的氧化損傷的作用.

在本研究中噴施H2O2對菠菜進(jìn)行模擬氧化脅迫時,7種SoAPX基因的轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度的升高,這可能是由于APX蛋白的主要作用就是清除植物體內(nèi)的活性氧,當(dāng)外源H2O2進(jìn)入植物體內(nèi)時,APX基因的表達(dá)作出響應(yīng),以應(yīng)對氧化脅迫對植物所產(chǎn)生的影響.

4 結(jié) 論

在菠菜基因組中鑒定出7個APX基因,對其基因結(jié)構(gòu)、保守基序和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析.同時對SoAPX在菠菜不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測與分析,明確了菠菜SoAPXs的組織表達(dá)模式.此外,還對SoAPX在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析.這些結(jié)果表明菠菜SoAPXs可能在抗鹽、耐寒、抗旱以及抗氧化脅迫中起作用,為后續(xù)深入鑒定APX家族成員的功能提供參考.