人參麥冬含片增強免疫力功能的實驗研究

姜 艷，朱春冬，周丹英，余 琪

(1.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州310023； 2. 浙江麥斯康萊醫(yī)藥有限公司，浙江 寧波315300)

中醫(yī)認(rèn)為肺氣不足可導(dǎo)致機體抗病能力降低，易感染外邪，易感冒，多有畏寒、流清涕之癥，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫力低下癥狀一致[1]。傳統(tǒng)經(jīng)典復(fù)方生脈散最早記錄于金代張元素的《醫(yī)學(xué)啟源》，“麥門冬，氣寒，味微苦甘，治肺中伏火，脈氣欲絕，加五味子、人參二味，為生脈散，補肺中元氣不足”[2]。原方中人參甘溫，益元氣，補肺氣，生津液，是為君藥；麥門冬甘寒養(yǎng)陰清熱，潤肺生津，用以為臣；人參和麥冬合用，益氣養(yǎng)陰之功益彰[3]。五味子為佐藥，斂肺止汗，生津止渴。本研究對以人參和麥冬為主要原料研制的含片進行免疫力功能的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ICR小鼠，SPF級，雌性，體重18～22 g，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 人參購于桓仁杏林堂參茸藥材有限公司，麥冬購于慈溪鎣瑞藥材專業(yè)合作社，山梨糖醇購于青島明月海藻集團有限公司，Hank’s液購于北京百奧萊博科技有限公司，刀豆蛋白A(ConA)、印度墨汁、Giemsa 染液購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液購于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。分析天平購于METTLER TOLEDO公司，離心機、酶標(biāo)儀購于Thermo Fisher Scientific公司，顯微鏡購于Leica Microsystems。

1.3 人參麥冬含片的制備 采用提取(8倍量水煎煮2次，每次1.5 h)、濃縮(減壓濃縮，真空度-0.07 MPa～-0.09 MPa，溫度：50～70℃)、微波干燥(真空度-0.07 MPa～-0.09 MPa，物料溫度35～55 ℃)、粉碎(過14目篩網(wǎng))、混合(與硬脂酸鎂混合20 min)和壓片等工序制備人參麥冬含片。人參麥冬含片的粗多糖(以葡萄糖計)含量為1 g/100 g，總皂苷(以人參皂苷Re計)含量為600 mg/100 g。

1.4 免疫力功能考察 小鼠飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～25℃，相對濕度40%～70%。實驗設(shè)三個劑量組和陰性對照組(蒸餾水)。低、中、高劑量分別為0.5、1.0、3.0 g/kg，相當(dāng)于人體推薦攝入量的5、10、30倍。每天灌胃一次，連續(xù)灌胃一個月，每組10只小鼠。參考文獻[4]進行免疫功能試驗。

1.4.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 分別制備各組灌胃后小鼠的脾細(xì)胞懸液，在脾細(xì)胞懸液中加入ConA液，T淋巴細(xì)胞受其刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過線粒體水解酶將3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)分解為藍紫色結(jié)晶而顯色，在570 nm波長處測得的光密度值(OD)減去不加ConA液的樣品的OD值為光密度值差，反應(yīng)淋巴細(xì)胞的增殖情況。

1.4.2 綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)試驗(足跖增厚法) 對各組灌胃后小鼠腹腔注射SRBC進行免疫，4 d后在小鼠左后足跖部皮下注射SRBC，24 h后測定左后足跖部厚度，以前后足跖厚度差值來表示遲發(fā)型超敏反應(yīng)的程度。

1.4.3 抗體生成細(xì)胞檢測(Jerne改良玻片法) 對各組灌胃后小鼠腹腔注射SRBC進行免疫，制備免疫小鼠的脾細(xì)胞懸液。SRBC與脾細(xì)胞懸液一起孵育，脾細(xì)胞懸液中的抗體生成細(xì)胞分泌的抗體與SRBC結(jié)合，激活補體可形成肉眼可見空斑，溶血空斑數(shù)反應(yīng)了抗體生成細(xì)胞活性。

1.4.4 小鼠血清溶血素測定(血凝法) 對各組灌胃后小鼠腹腔注射SRBC進行免疫，采集各組免疫小鼠血清，SRBC與血清中抗體(溶血素)結(jié)合，在補體參與下發(fā)生凝集，觀察血球凝集程度，計算抗體積數(shù)。

1.4.5 小鼠碳廓清試驗 各組灌胃后小鼠尾靜脈注射印度墨汁，碳顆粒經(jīng)血流帶到肝脾等處，進而被這些部位的巨噬細(xì)胞吞噬清除。注入墨汁后2 min，10 min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，在600 nm波長處測定值，并稱定各組灌胃后小鼠的體重、肝、脾重量，根據(jù)兩個時間點的值計算系數(shù)K=(lg1-lg2)/(t2-t1)，吞噬指數(shù)=體重/(肝重+脾重)×K1/3。

1.4.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(滴片法) 對各組灌胃后小鼠腹腔注射SRBC進行免疫，提取各組免疫小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞并與雞紅細(xì)胞一起孵育，Giemsa液染色，鏡檢，計數(shù)100個巨噬細(xì)胞并計數(shù)其中吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞；計數(shù)100個吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞并計數(shù)其中雞紅細(xì)胞的數(shù)量。吞噬率=吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)，吞噬指數(shù)=吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.4.7 自然殺傷(NK)細(xì)胞活性測定(LDH測定法) 分別制備各組灌胃后小鼠的脾細(xì)胞懸液(含有NK細(xì)胞)作為效應(yīng)細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞(YAC-1)作為靶細(xì)胞，一起培養(yǎng)作為實驗組；YAC-1與培養(yǎng)液一起培養(yǎng)作為自然釋放組；YAC-1與1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40)一起培養(yǎng)，作為最大釋放對照組。靶細(xì)胞受到NK細(xì)胞殺傷后，靶細(xì)胞內(nèi)含有的乳酸脫氫酶(LDH)釋放。在酶標(biāo)儀490 nm波長下測定各組混合液的OD值，NK細(xì)胞活性=(實驗組OD值-自然釋放組OD值)/(最大釋放對照組OD值-自然釋放組OD值)。

1.4.8 臟器/體重比值 稱量各組灌胃后小鼠的體重、胸腺和脾臟重量，計算胸腺/體重和脾臟/體重比值。

2 結(jié)果

2.1 對 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 與陰性對照組光密度值差(0.081±0.053)比較，低劑量組(0.121±0.096)、中劑量組(0.162±0.091)、高劑量組(0.134±0.061)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 對SRBC誘導(dǎo)小鼠DTH的影響 與陰性對照組左后足跖部24 h厚度差(0.050±0.025 cm)比較，低劑量組(0.092±0.019 cm)、中劑量組(0.102±0.033 cm)和高劑量組(0.088±0.019 cm)小鼠左后足跖部24 h厚度差值均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響 與陰性對照組溶血空斑數(shù)(22.0±2.2個)比較，低劑量組(22.7±2.4個)、中劑量組(22.4±1.6個)、高劑量組(23.7±2.4個)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 對小鼠血清溶血素影響 與陰性對照組抗體積數(shù)(58.7±11.3)比較，低劑量組(62.1±10.7)、中劑量組(67.4±9.0)、高劑量組(69.4±12.8)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 對小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)的影響 與陰性對照組吞噬指數(shù)(5.06±0.79)比較，低劑量組(7.32±1.52)、中劑量組(6.04±1.62)和高劑量組(5.89±0.97)的小鼠吞噬指數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的影響 與陰性對照組(吞噬率27.4±3.9%，吞噬指數(shù)0.34±0.05)比較，低劑量組(吞噬率27.2±2.7%，吞噬指數(shù)0.36±0.03)、中劑量組(吞噬率27.5±4.2%，吞噬指數(shù)0.36±0.05)、高劑量組(吞噬率27.7±4.2%，吞噬指數(shù)0.37±0.04)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 對小鼠NK細(xì)胞活性的影響 與陰性對照組的NK細(xì)胞活性(68.8±4.0%)比較，中劑量組(82.9±5.5 %)和高劑量組(89.7±3.6 %)小鼠NK細(xì)胞活性均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.8 對小鼠臟器/體重比值的影響 與陰性對照組(胸腺/體重2.74±0.68 mg/g，脾臟/體重5.09±1.00 mg/g)比較，低劑量組(胸腺/體重2.81±0.42 mg/g，脾臟/體重4.61±0.96 mg/g)、中劑量組(胸腺/體重2.88±0.43 mg/g，脾臟/體重0.36±0.05 mg/g)、高劑量組(胸腺/體重2.79±0.51 mg/g，脾臟/體重4.72±0.84 mg/g)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

機體免疫功能主要分為特異性免疫和非特異性免疫，特異性免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫。ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH試驗用于評價細(xì)胞免疫功能，抗體生成細(xì)胞檢測和小鼠血清溶血素測定用于評價體液免疫功能，小鼠碳廓清試驗和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗用于評價單核-巨噬細(xì)胞功能(非特異性免疫)。NK細(xì)胞是沒有T細(xì)胞和B細(xì)胞表面標(biāo)志的淋巴細(xì)胞，具有非特異性殺傷作用。

人參麥冬含片由人參、麥冬組成，含有皂苷、多糖等有效成分。據(jù)文獻報道[5-6]，人參具有促進小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，提高免疫因子含量的作用。麥冬具有提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。本研究結(jié)果顯示，人參麥冬含片三個劑量組均能促進小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，促進小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清作用；人參麥冬含片中、高劑量組能夠增強小鼠NK細(xì)胞活性。人參麥冬含片在本研究中未體現(xiàn)增強體液免疫功能的作用。結(jié)果提示，人參、麥冬按比例配制的人參麥冬含片對正常小鼠在細(xì)胞免疫和非特異性免疫(包括單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和NK細(xì)胞活性)方面具有免疫增強作用。