聶金運 翁詠桃 羅志偉 薛燕芬

1.深圳市龍崗區(qū)慢性病防治院檢驗科 (廣東 深圳， 518172)；2.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院檢驗科； 3.深圳市龍崗區(qū)橫崗人民醫(yī)院檢驗科

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種功能最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子。乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是細(xì)胞應(yīng)對缺氧微環(huán)境狀態(tài)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對多種缺氧反應(yīng)具有調(diào)控作用。脂蛋白α(Lp-α)是一種與低密度膽固醇相似的特殊脂蛋白。microRNAs(miRNAs)是一類不編碼蛋白質(zhì)，單鏈的小RNA，由19～30個核苷酸組成，在細(xì)胞功能調(diào)控多方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，VEGF、HIF-1α、Lp-α及miRNAs濃度的高低與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)性[1～3]，其中一些miRNA呈現(xiàn)出促癌或抑癌作用[4]。因此，筆者通過對不同肝病患者血中VEGF、HIF-1α、Lp-α及miR-152-3p濃度檢測，探討其在不同肝病患者血液中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年2月至2017年10月在深圳龍崗區(qū)慢性病防治院和龍崗區(qū)中醫(yī)院就診并確診的肝病患者。其中CHB 216例，男117例，女99例，年齡18～63歲，平均(38.6±17.63)歲；LCI患者59例，男32例，女27例，年齡35～71歲，平均(42.9±22.05)歲，參照Pugh改良計分法將LCI患者分為3級，其中A級21例,B級27例和C級11例；LCA患者25例，男16例，女9例，年齡41～76歲，平均(48.2±23.35)歲。

診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會2012版《肝癌規(guī)范化診治指南》，所有病例術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診為LCA，依據(jù)UICC分級標(biāo)準(zhǔn)分為I期6例、Ⅱ期10例和Ⅲ期9例，所有LCA患者檢測前均未接受放、化療及抗腫瘤藥物治療。同時選擇同期健康人群(HCO)120例，男女各60例，年齡27～70歲，平均(39.0±19.23)歲，均無重要器官實質(zhì)性疾病史，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)均正常。本臨床研究已經(jīng)通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 日立7600全血動生化分析儀、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品及配套試劑均由日本日立公司提供，Lp-α試劑由浙江寧波美康公司提供；MB-530全自動酶免分析儀由匯松生物有限公司提供；HIF-1α和VEGF試劑盒由上海藍(lán)基生物科技有限公司提供；SLAN-96P型PCR分析儀由上海宏石醫(yī)療科技有限公司提供；ABI step one plus熒光PCR分析儀由美國ABI公司提供；血漿miRNA提取試劑盒 (miReasy Mini Kit)、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScript Reverse Transcription Kit)和實時熒光定量PCR試劑盒(miScript SYBR Green PCR Kit)均由德國Qiagen公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有受試者均于清晨空腹用一次性真空采血管分別采集靜脈血3～4ml于無抗凝劑干燥管內(nèi)和2～3ml于EDTA-2K抗凝管內(nèi)混勻，及時送檢。

1.3.2 標(biāo)本處理 標(biāo)本置室溫30min后3000r/min離心15min，分離血清和血漿，血清VEGF、HIF-1α和Lp-α于4小時內(nèi)檢測完畢，不能及時檢測的血清標(biāo)本于-20℃保存，檢測時取出室溫復(fù)溶，復(fù)溶后30min后進(jìn)行檢測。取500μl血漿于1.0ml冷凍管內(nèi)置于-80℃低溫保存，供miR-152-3p檢測用。

1.3.3 LP-α、HIF-1α、VEGF的檢測 LP-αα檢測前對7600全自動生化分析儀進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)、校準(zhǔn)及室內(nèi)質(zhì)控物檢測，待質(zhì)控結(jié)果在控后才進(jìn)行標(biāo)本檢測；HIF-1a和VEGF檢測前對MB-530全自動酶免分析儀進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)，并對比色靈敏度進(jìn)行校正，且每批均設(shè)置空白、陰性、陽性和質(zhì)控檢測孔，待以上各質(zhì)控孔的OD值均在試劑盒說明書上規(guī)定的有效范圍內(nèi)后才進(jìn)行標(biāo)本結(jié)果判讀，否則重新試驗。所有操作均嚴(yán)格按實驗室SOP操作規(guī)程及儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 microRNA提取 取400μl低溫冷藏的血漿樣本，加入5倍體積的QIAzol試劑，置于冰上融化，充分混勻，置室溫5min，加入等體積100%氯仿，振蕩混勻，室溫放置2～3min后于4℃離心機(jī)內(nèi)離心15min(相對離心力12000g)，取上層水相300μl轉(zhuǎn)移至新的離心管中，取加入1.5倍體積100%乙醇，充分混勻。按miReasy Mini Kit的操作手冊用吸附柱提取RNA。用30μlRNase-free water溶解RNA，置于-80℃低溫冰箱保存。

1.3.5 miR-α152-α3p檢測 取15μl RNA樣本，加入4μl Buffer RT和1μl Mix，于PCR儀上進(jìn)行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37℃ 1h，95℃ 5min。qPCR反應(yīng)按miScript SYBR Green PCR Kit按試劑盒操作說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系：miScript SYBR Green Mix 10μl，PCR正向和反向引物各0.4μl，模板cDNA 1μl，加滅菌蒸餾H2O 至20μl。在ABI step one plus熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃ 15min；94℃ 30s，55℃ 15s，70℃ 30s，40個循環(huán)。每份cDNA均在相同條件下進(jìn)行miR-152-3p的檢測，設(shè)立重復(fù)實驗和陰性對照實驗，所有樣本重復(fù)3次，陰性對照以DEPC 水代替模板cDNA。

1.3.6 miRNA-152-3p濃度相對水平計算 濃度相對水平(Re)采用比較CT法定量，計算方法為2-△△CT法，計算公式為△CTc=CTc目的-CTc內(nèi)參，△CTn=CTn目參-CTn內(nèi)參(c為肝癌患者，n為健康人群)。濃度相對水平進(jìn)行對數(shù)(log2Re=-△CT)處理后，計算miRNA-152-3p基因的起始模板量從而反映出miRNA-152-3p基因的濃度相對水平。

2 結(jié)果

2.1 4組人員外周血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果 見表1。

表1 4組人員外周血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果比較

LCA患者血清中VEGF，HIF-1α和Lp-α濃度明顯高于CHB、LCI和HCO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.015～17.032,P<0.01～0.05)，而miR-152-3p濃度相對水平明顯低于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.825～6.106,P<0.05)；CHB,LCI和HCO組人員血清中VEGF和HIF-1α濃度及miR-152-3p濃度相對水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.417～0.925,P>0.05)；CHB和HCO組人員Lp-α濃度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.802,P>0.05)，而LCI組患者血中LP-α明顯低于CHB和HCO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.205～7.163,P<0.05)。

2.2 不同分級LCI患者血清中Lp-α檢測結(jié)果 A級和B級LCI患者血清中Lp-αα濃度分別為(130.56±49.82)mg/L和(119.45±39.68)mg/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.492,P>0.05);而C級LCI患者血清中Lp-α濃度為(69.26±28.75)mg/L，明顯低于A級和B級，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.945～5.607,P<0.05)。

2.3 不同分期LCA患者外周血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果 見表2。

表2 不同分期LCA患者外周血相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果比較

Ⅰ期和Ⅱ期LCA患者血清中VEGF和 HIF-1α濃度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.005～1.519,P>0.05)；Ⅰ期LCA患者血清中Lp-α濃度低于Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.485,P<0.05);Ⅲ期LCA患者血清中的VEGF，HIF-1α和 Lp-α濃度均明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.895～7.826,P<0.05),而Ⅲ期LCA患者血漿中miR-152-3p濃度相對水平明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.214～4.517,P<0.05)。

3 討論

我國乙肝病毒感染率約60%左右，乙肝表面抗原攜帶率約占總?cè)丝诘?.18%，全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬，是WHO統(tǒng)計的感染人數(shù)最多的37個國家之一[5]。主要臨床表現(xiàn)為乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、厭油、肝腫大及肝功能異常，部分患者有發(fā)熱和黃疸[6，7]。若不及時治療，少數(shù)患者病情遷延轉(zhuǎn)為慢性，或發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。而肝癌(LCA)發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，且肝臟血流極為豐富，腫瘤細(xì)胞生長迅速，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。給LCA早期診斷和治療帶來極大困難[8～10]。因此，及時發(fā)現(xiàn)、診斷及鑒別診斷不同類型肝病，并及時采取有效治療措施，對預(yù)防肝硬化和肝癌具有重要意義[11]。

VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)和特異性最高的血管生成調(diào)控因子。已有研究結(jié)果表明，VEGF含量與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1，2]。本研究結(jié)果顯示，LCA患者血清中VEGF濃度明顯高于CHB、LCI及HCO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而CHB、LCI及HCO組之間差異均無統(tǒng)計意義，這可能與VEGF與受體結(jié)合刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和增殖，從而促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖及血管形成等因素有關(guān)。

HIF-1a是細(xì)胞應(yīng)對缺氧微環(huán)境狀態(tài)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-la和HIF-1β兩個亞基構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1α位于細(xì)胞核，對多種缺氧反應(yīng)具有調(diào)控作用。已有研究結(jié)果表明，HIF-1a與人體大多數(shù)惡性腫瘤相關(guān)，在維持腫瘤細(xì)胞的新陳代謝、腫瘤血管生成、腫瘤組織的侵襲性和轉(zhuǎn)移增殖等方面具有重要作用[12，13]。本研究結(jié)果顯示，LCA患者血清中HIF-1α濃度明顯高于CHB、LCI及HCO患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而CHB、LCI及HCO組之間差異均無統(tǒng)計意義，這可能與機(jī)體在缺氧微環(huán)境狀態(tài)下，HIF-1α與VEGF等缺氧反應(yīng)元件結(jié)合并激活其功能，參與血管生成等有關(guān)。

Lp-α是一種與低密度膽固醇結(jié)構(gòu)相似的特殊脂蛋白，由載脂蛋白A和載脂蛋白B通過二硫鍵連接而成。有研究證實，Lp-α濃度升高與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[3]。本研究結(jié)果顯示，LCI患者血清中Lp-α濃度明顯降低，且隨LCI分級增加而下降,這可能與與慢性肝損害引起肝臟合成蛋白及脂質(zhì)功能障礙有關(guān)。但LCA患者卻明顯升高，明顯高于LCI患者，且隨LCA分期增加而升高，這可能與Lp-α能抑制纖溶酶原活化，導(dǎo)致局部容易形成纖維蛋白網(wǎng)和血栓，有利于惡性腫瘤細(xì)胞黏附于血管相應(yīng)部位，亦可能與激活血小板釋放血小板源性生長因子，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及生長等因素有關(guān)[14]。可見，Lp-α有助于LCI和LCA的診斷、鑒別診斷及分級或分期。

隨著生命科學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)miRNA特異性表達(dá)與癌癥發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性[15]。近期研究表明，多種miRNA參與了癌細(xì)胞重要生物程序的調(diào)控，發(fā)揮了抑癌基因或促癌基因的功能，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起了重要的作用，且miRNA在腫瘤的診斷、治療及療效判斷中作用也越來越受到重視[16,17]。本研究結(jié)果顯示，LCA患者血清中miR-152-3p相對濃度水平明顯低于CHB、LCI及HCO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜以上述，LCA患者血清中VEGF、HIF-1α及Lp-α濃度明顯升高，隨分期或分級增加而升高，miR-152-3p相對濃度水平明顯降低，隨分期增加而下降，且Lp-α在LCI患者血清中降低，且隨分級增加而降低。因此，聯(lián)合檢測VEGF、HIF-1α、Lp-α及miR-152-3p濃度，對不同類型肝病的診斷、鑒別診斷及分期具有重要的意義。