生物3D打印高分子材料發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢

毛宏理，顧忠偉

(南京工業(yè)大學 材料科學與工程學院，江蘇 南京 211816)

1 生物3D打印概述

3D打印，又稱增材制造，已廣泛應用于航天航空、國防軍事、健康醫(yī)療、文化教育等領域[1, 2]。該技術的產生與發(fā)展帶來的不僅僅是制造模式的變化、技術的創(chuàng)新，更重要的是觀念的創(chuàng)新、思維模式的創(chuàng)新，它最終將帶來制造業(yè)的翻天覆地的變化[3, 4]。其核心價值主要體現(xiàn)在：① 通過3D打印技術能夠直接制造出傳統(tǒng)生產方式所不能制造的個性化、復雜度高的產品；② 3D打印技術可以快捷、方便、短周期、低成本地生產制造出傳統(tǒng)生產方式雖然也能制造，但投入成本高、周期長的產品，有效解決了個性化定制與規(guī)?；可a的矛盾。

生物3D打印作為3D打印的一個重要分支，是基于“增材制造”的原理，以特制生物“打印機”為手段，以加工活性材料包括生物材料、生長因子、細胞等為主要內容，以重建人體組織和器官為目標的跨學科、跨領域的新型再生醫(yī)學工程技術，也是3D打印目前最富有生命力和發(fā)展?jié)摿Φ暮诵慕M成部分，代表了目前3D打印技術的最高水平之一[5-8]。

1.1 生物3D打印技術

根據(jù)所打印基質材料的不同，生物3D打印分為金屬3D打印、陶瓷3D打印、聚合物3D打印、細胞生物3D打印等，分別涉及不同的打印設備、技術和工藝[9-11]。本文將著重介紹聚合物3D打印和細胞生物3D打印的研究概況。

1.1.1 聚合物材料3D打印

聚合物材料3D打印技術主要包括激光選區(qū)燒結技術(selective laser sintering, SLS)、熔融沉積技術(fused deposition modeling, FDM)、立體光固化技術(stereo lithography appearance, SLA)以及聚合物噴射技術(PolyJet)(圖1)。

圖1 4種常見的聚合物材料3D打印技術[12-17]Fig.1 Main technologies used for polymer 3D printing[12-17]

SLS是控制激光在鋪設好的粉末上方選擇性地對粉末進行照射，激光能量被選區(qū)內的粉末吸收并轉換為熱能，加熱到燒結溫度的粉末顆粒間接觸界面擴大、氣孔縮小、致密化程度提高，然后冷卻凝固變成致密、堅硬的燒結體過程[12-14]。目前，采用該技術成型的常用聚合物主要為尼龍(PA)、聚醚醚酮(PEEK)等材料。該技術起源于美國德克薩斯大學澳斯汀分校(University of Texas at Austin)，于1988年研制成功了第一臺SLS成形機。隨后，由美國的DTM公司將其商業(yè)化，2001年，DTM被3D System公司收購。

FDM成型是將絲狀原料通過送絲部件送入熱熔噴頭，然后在噴頭內被加熱融化，在電腦控制下噴頭沿著零件截面輪廓和填充軌跡運動，將半流動狀態(tài)的材料送到指定位置并最終凝固形成成品[15]。該技術是20世紀80年代末，由美國Stratasys公司發(fā)明的技術。在健康醫(yī)療領域，F(xiàn)DM 3D打印通常用來制作等比例實體模型，用于術前模擬手術、培訓、展示等。

PolyJet工作原理與傳統(tǒng)噴墨打印機十分類似，不同的是噴頭噴射的不是墨水而是光敏聚合物[16, 17]。該技術由以色列Objet公司在2000年初推出專利技術，后該公司被Stratasys公司收購。目前該技術產品主要包括Stratasys公司的Objet 、Connex、 EDEN等系列產品，醫(yī)療健康領域聚合物PolyJet 3D打印產品多集中在手術規(guī)劃用的醫(yī)療模型、手術導板等。

1.1.2細胞生物3D打印

細胞生物3D打印的主要方式是將細胞等具有生物學功能的材料通過注射器擠壓式預置組成特定的形體組織，打印制備活體器官和組織。

(1)細胞生物3D打印機原理

根據(jù)工作原理的不同，現(xiàn)階段細胞生物3D打印所采用的成型技術主要分為噴墨、微擠壓和激光輔助這3種方法(圖2)[18-24]。如表1所示，3種打印方式具有各自不同的優(yōu)缺點。

圖2 現(xiàn)階段細胞生物3D打印所采用的技術[18-24]Fig.2 Main technologies used for cell biology 3D bioprinting[18-24]

噴墨式生物3D打印是3種打印方式當中技術門檻最低的。常見的噴墨式打印機通過將墨水換成粘稠度相近的生物墨水，就可以實現(xiàn)最簡單的二維生物打印。它的原理就是在噴嘴處利用壓電陶瓷或者微型的加熱器，在噴嘴處瞬間產生一個升壓，將生物墨水從噴嘴擠壓出去，從而形成液滴。

擠出式的細胞打印技術中，常見的是向生物墨水的管路系統(tǒng)用氣泵增壓，使得管路內部壓強比外界要大，從而使內部生物墨水從噴嘴流出。除使用氣泵之外，也有使用活塞或螺旋桿等方式的，其能夠打印粘度更高的生物墨水。

除以上兩種之外，激光輔助式生物打印技術(LaBP)在2004年出現(xiàn)技術原型。現(xiàn)在的LaBP技術原理是將生物墨水涂覆在鍍制在透明玻璃板上的吸收層之上，形成玻璃板-吸收層-生物墨水層的三層結構，然后脈沖激光聚焦在吸收層上，使得照射位置的生物墨水層，有一小部分溶液氣化膨脹，將該處的生物墨水擠離表面，形成射流，然后沉積在接收基板上。

(2)細胞生物3D打印主要技術難點

首先是細胞活性。對于噴墨式與擠出式打印，其難點在于生物墨水流出時承受的剪切力會損傷細胞，尤其是噴嘴尺寸減小后，而噴嘴尺寸決定了打印精度，細胞活性和打印精度難以兼得。

表1 細胞生物3D打印所采用的3種打印方法的各自特點

其次是交聯(lián)成型。生物墨水圖樣化需要通過溫控、化學處理、紫外照射等方式固定成型。然而這些交聯(lián)方式都會對細胞、蛋白質等材料造成損傷。

第三是高通量，即多材質細胞生物3D打印技術。對于具備一定功能的生物組織，其內部應該具備多種細胞、蛋白、生長因子等，材料分布非常復雜，精度非常高。這對打印技術提出了巨大的挑戰(zhàn)。

1.2 生物3D打印在健康醫(yī)療領域中的應用

事實證明，3D打印技術與醫(yī)學的結合能夠解決很多傳統(tǒng)醫(yī)學很難甚至是無法解決的難題。例如，傳統(tǒng)醫(yī)學能夠獲得患者的三維影像學資料，卻不能提供更為直觀形象的三維實體模型，尤其是復雜的病損部位。因而，3D打印在醫(yī)療健康領域具有重要的研究意義與應用價值。

(1)3D打印仿真解剖模型讓醫(yī)學教學更直觀(圖3a)。人體解剖學是3D打印應用最多的基礎學科。人體解剖學是最重要的一門基礎醫(yī)學學科，其中尸體解剖又是最重要的教學手段。尸體解剖不僅實踐性強，更可使學生直觀了解人體器官結構、位置、相互關系，促進學生對人體結構與疾病關系的認識。然而，目前越來越多的國家及地區(qū)面臨著尸體短缺的情況，無法滿足教學需要。因此，利用3D打印制備解剖結構模型甚至是標準化“人造尸體”(artificial cadavers)用于解剖學教學成為了近年來研究的熱點。3D打印出的解剖模型可解決標本短缺及相關倫理問題，有效避免學生對尸體“恐懼”感，提高教學質量。同時，3D打印出的解剖模型易于保存、搬遷，不易損壞，且可實現(xiàn)快速批量生產，具有較高的性價比。此外，通過3D打印技術可對經典病例、罕見臨床情況進行忠實記錄和高度復制，使醫(yī)學教學不再局限于基本知識的技能講授，這一應用將對高級研修培訓和技術探索產生積極的影響。

(2)3D打印將推動個性化和精準化醫(yī)療快速發(fā)展。個性化和精準化醫(yī)療是未來醫(yī)療發(fā)展的重要方向，目前3D打印助力個性化精準醫(yī)療的發(fā)展主要體現(xiàn)在兩個方面。一是在針對人體“硬性支撐”(牙齒、盆骨、關節(jié)、心臟支架和骨骼修復等)應用方面的個性化定制。以矯正義肢為例，3D打印技術可以實現(xiàn)患者截肢部分的1∶1復制，為截肢患者定制出完美契合的假肢(圖3b)。又比如，當前口腔醫(yī)療中所用的人工牙種植體，都是統(tǒng)一標準件型號，尺寸相對固定，很難與患者的拔牙窩完全吻合；而且種植手術操作非常復雜，整個治療周期長達6～8個月。而結合3D打印技術，可以高精度、低成本、高效率重塑患者原來的牙齒，省去預備植牙孔、植入骨粉等步驟，不僅縮短治療周期，同時還能達到微創(chuàng)、精準、快速治療的目的(圖3c)。二是針對復雜、罕見、高難度病例的術前規(guī)劃與精準演練。每個人的身體構造、病理狀況都存在特殊性和差異化，尤其是病情復雜、罕見的患者，考慮到手術風險較大，醫(yī)生可借助3D打印技術，將患者病變部分按照1∶1的比例完整打印出來。這不僅為醫(yī)生設計手術方案提供精準的三維立體結構數(shù)據(jù)，也可在更直觀更真實的前提下預演整個手術過程，完善手術規(guī)劃，從而提高真實手術的精準度，降低手術風險。此外，針對不同患者，3D打印個性化手術導板，能夠有效減少手術的創(chuàng)傷和出血量，大大縮短手術時間，提高手術準確度。因而，與傳統(tǒng)醫(yī)療技術相比，在尊重和掌握個體差異的基礎上，3D打印技術能夠實現(xiàn)真正個性化定制，使醫(yī)療更加精準化。

圖3 生物3D打印在生物醫(yī)學領域的應用范例：(a)澳大利亞Monash University團隊開發(fā)仿真醫(yī)學模型，(b)Adam Root公司開發(fā)的3D打印Exo-Prosthetic假肢，(c)北京大學口腔醫(yī)院自主研發(fā)的3D打印全口義齒，(d)Harvard University研發(fā)的系列3D打印器官芯片(Organ-on-a-Chip)，(e)Wake Forest Institute for Regenerative Medicine開發(fā)的多模塊3D打印器官芯片F(xiàn)ig.3 Typical examples of the applications of 3D bioprinting in biomedical field: (a) 3D printed anatomy from Monash University, (b) 3D printed exo-prosthetic from Adam Root, (c) 3D printed denture from School of Stomatology of Peking University, (d) 3D printed Organ-on-a-Chip from Harvard University and (e) developed by experts in Wake Forest Institute for Regenerative Medicine

(3)生物3D打印將有助于解決新藥篩選周期長、成本高和效率低的問題。醫(yī)藥市場需求不斷增長，醫(yī)藥創(chuàng)新格局越來越受企業(yè)關注。然而，在制藥過程中，由于缺乏準確的藥物篩選模型，新藥研發(fā)一直是個高成本、低效率和高風險領域。國際上單個創(chuàng)新藥物的開發(fā)成本普遍超過10億美元，耗時10年左右。理論上來講，進行藥物篩選最佳的方法是用人體，但這是法律道德不允許的。目前的藥物篩選技術主要是高通量藥物篩選和動物模型藥物篩選。其中高通量藥物篩選模型與體內環(huán)境差異大，藥物篩選相關率小于1%；動物模型則存在種屬差異和周期長等缺點，篩選無關率達58%，平均每100個動物試驗結果，好的藥物只有不到10個可以走完臨床試驗，這使得新藥的轉化率極低。生物3D打印可以精確地堆疊各種細胞及支架材料，形成接近實際器官組織的結構，同時其細胞也可采用人類的細胞，恰好可以彌補目前常用的兩大藥物篩選方式的缺點。因而，用生物3D打印出來的組織器官進行藥物篩選，將給整個藥物篩選體系帶來革命性的改變(圖3d和3e)。未來幾年，生物3D打印或將迎來一段突破期，打開一個全新的市場。

(4)生物3D打印將有望解決器官移植來源匱乏問題。迄今為止，許多醫(yī)學難題諸如腎衰竭、惡性腫瘤等，臨床上的行之有效的治療方式仍為器官移植手術，然而異體器官移植一直以來都存在著供體不足的問題。在美國，根據(jù)美國器官資源共享網(wǎng)絡(UNOS)公布，每1.5 h就有1例病人因為等不到合適的器官移植而死亡，每年有超過800萬例患者需要進行組織修復相關手術。在我國，據(jù)統(tǒng)計每年大約有150萬人因末期器官功能衰竭需要器官移植，但每年卻僅有約1萬人能得到器官移植的救治，有限的活體器官來源滿足不了患者需求。單以腎移植手術為例，每年進行移植的患者為3000人，而需求者高達30萬。大多數(shù)患者只能在等待配體的過程中病情惡化甚至離世。與此同時，中國需要接受器官移植的患者數(shù)量還在以每年超過10%的增量擴大。另外，器官移植后還存在免疫排異反應，需要長期進行免疫抑制治療。有鑒于此，臨床上急需一種行之有效的方法，以解決供體器官的短缺和器官移植出現(xiàn)的排異反應等問題。生物3D打印技術的出現(xiàn)及快速發(fā)展為組織/器官短缺的問題提供了全新的解決方案。研究表明，生物3D打印可以以自身的成體干細胞經體外誘導分化而來的活細胞為原料，在體外或體內直接打印活體器官或組織，從而取代功能喪失的器官或組織。目前，生物3D打印在器官移植領域已取得了一定的成績，被應用于皮膚、骨骼、人造血管、血管夾板、心臟組織和軟骨質結構的再生與重建。

2 生物3D打印材料特性要求

2.1 可打印性

可打印性指的是材料能夠在空間和時間維度上精準可控增材成型的性能，即用于打印的材料必須可以在一定的時間內精確地沉積在所指定的空間內，該性能直接關系到3D打印產品是否能取得期望的結構與尺寸精度。針對不同的打印工藝，對材料可打印性的需求也會有所不同。例如噴墨打印，對材料粘度有很大的限制，同時需要材料具有能夠快速交聯(lián)的性能以促進復雜3D結構的分層成型；而微擠壓打印，則可以使用高粘性材料，以保持打印后初期的3D形狀，并可通過打印后的交聯(lián)形成最終穩(wěn)定的結構，因而要求材料應具有特定的交聯(lián)機制或剪切稀化性質。

在進行載細胞生物打印時，打印參數(shù)如噴頭尺寸，會直接影響到材料內細胞所受到的剪切應力及材料沉積形成3D結構所需的時間[25, 26]。因此，在考量材料可打印性能時應同時考慮到材料對細胞活性的保護能力[27]。例如，熱噴墨打印和激光輔助打印都涉及到材料的局部加熱，因而具有低熱導率或在打印過程中具有熱緩沖能力的材料將會有利于細胞活性和功能的維持。打印后的細胞存活率隨打印機規(guī)格、材料特性、打印分辨率和細胞類型的不同而顯著變化，但通常情況下，噴墨生物打印的細胞存活率大于85%，微擠壓打印的細胞存活率為40%～80%，激光輔助打印的細胞存活率高達90%。

細胞生物打印所用的生物墨水為典型的軟物質材料，其打印性通常包括3層含義：① 生物墨水的粘度要能調控，比如通過溫度變化、剪切應力等。只有粘度可調才能設計出適合的打印方式及打印參數(shù)。② 生物墨水在打印前需要是流體或半流體狀態(tài)，以避免堵塞噴嘴，打印后要能迅速固化以保持形狀。在逐層打印的過程中，不同層間的粘結也非常重要，這決定了該材料或該打印工藝是否是真正的3D打印。③ 擁有或能找到針對該材料的打印窗口或工藝參數(shù)區(qū)間。目前有大量的看起來很理想的新型生物材料或生物墨水的研發(fā)報道，但最終因這些墨水只能局限于某些簡單的成型，而失去實際應用價值。

2.2 生物相容性

隨著組織工程與再生醫(yī)學研究的深入，人們對生物相容性的認識已從最初的要求材料能夠與組織器官共存，且不引起宿主任何不良的局部或系統(tǒng)反應，發(fā)展到植入材料需要與宿主產生積極的相互作用，包括與宿主組織和/或免疫系統(tǒng)的相互作用，以達到調控宿主細胞、組織和器官活性與功能的目的[28, 29]。目前，3D打印用于體外輔助醫(yī)療時，包括打印體外使用的醫(yī)學模型、醫(yī)療器械、康復輔具、假肢、手術導板等，對材料生物相容性的要求較低，只需要材料能夠提供適合的力學強度和可打印性能。當3D打印用于制備植入性醫(yī)療器械產品(如3D打印骨骼、軟骨、關節(jié)、牙齒、義眼等永久植入替代物)、組織工程支架以及含細胞的組織器官替代物時，要求材料應具有良好的生物相容性。

從材料角度講，生物相容性主要受材料的化學組成、結構形態(tài)(如多孔結構/絲狀結構)、表面特性(如親疏水性)、表面電荷以及材料的力學性能、物理化學特性等因素的影響[30, 31]。因此，為提高3D打印材料生物相容性，可以對材料：① 進行表面改性，如改變材料拓撲結構(包括微納米尺度結構)、調控材料的表面親疏水性(研究表明，較強的親水性及較強的疏水性都有可能提高材料的生物相容性)、改變材料表面的電荷強度以及制備活性分子的表面涂層；② 進行不同類型材料的雜化，如結合天然與合成材料二者的優(yōu)點來改善材料力學性能等的同時，提高材料的生物相容性；③ 通過仿生原理，制備出與生命體具有相同或相似結構與性能的材料；④ 復合材料的研制，如將高分子材料與納米材料/生物活性因子等復合，制備生物相容性材料。

2.3 力學穩(wěn)定性

材料具有一定的力學強度，能夠一定程度上抵抗外界作用力，維持打印物的形貌結構，對于打印物功能的發(fā)揮起著重要作用[32, 33]。在材料打印過程中，應根據(jù)實際應用目標，選擇設計具有不同力學特性的打印材料。例如，在3D打印構建組織器官的相關研究中，應根據(jù)不同靶組織器官(如皮膚、肝臟、軟骨、骨等)所需的結構力學環(huán)境，選用具有相應力學特性的打印材料。另外，在打印過程中，尤其是必須選用力學性能較差的天然高分子材料進行打印時，可選擇力學性能較好的犧牲材料作為支撐[34, 35]。該支撐材料應在成型或交聯(lián)穩(wěn)定后很容易從打印結構中除去，且其自身及其去除時的中間產物對打印物的結構及其它性能不產生負面影響。

2.4 降解特性

理想的生物打印材料，植入體內后應當隨著細胞的增殖及細胞外基質(ECM)的產生而逐漸降解，且降解速率應當與細胞產生ECM替換植入材料的速率，及新組織生成的速率相匹配[36]。同時，降解產物也應無毒、易于代謝、能夠迅速排出體外。有害降解產物通常包括小分子量蛋白質或其它能夠改變機體局部pH值、溫度等，進而對細胞的生存和功能產生不良影響的分子。

2.5 仿生功能

近年來隨著研究的深入，仿生學對于理想生物材料研發(fā)的重要性逐漸彰顯出來。研究表明，向打印材料中加入細胞活性配體或將仿生組分加入到生物打印構建體中，可顯著改善內源和外源細胞的黏附、遷移、增殖和功能表達等[9, 37]。同時，構建體的微納尺度環(huán)境特征會直接影響到細胞的形態(tài)、增殖及分化等[38]。

為構建具有特定生理功能的3D打印材料，ECM將是最好的仿生對象[39-41]。在哺乳動物體內，有超過300種ECM蛋白、多種ECM修飾酶和ECM結合生長因子，以及其他ECM相關蛋白。其中最豐富且研究最多的是膠原蛋白、蛋白多糖和糖蛋白。這些蛋白質提供強度支撐、空間填充、結合生長因子、調控細胞命運、參與細胞信號傳導等功能。脫細胞ECM可提供完整的ECM支架，用于ECM組成、空間分布和生物學功能的詳細分析[42, 43]。利用3D打印技術精準調控功能性材料的呈現(xiàn)，實現(xiàn)特異性ECM的體外復制，將是構建具有仿生特性材料體系的一個重要方面。

生物打印仿生的另一個方面，則是通過打印細胞或細胞聚集體，使其產生并沉積ECM，自發(fā)構建出適合細胞自身生長的微環(huán)境，進而促進自身功能的發(fā)揮。該方面研究的一個挑戰(zhàn)是開發(fā)出能夠通過生物打印技術將合適的材料恰當?shù)亟Y合到構建體中的方法，同時要確保材料具有合適的降解時間和副產物，并且這些材料在構建體中具有明確可控的結構特征和生物學功能。

3 用于生物3D打印的高分子材料

理想的生物3D打印材料要有合適的粘度、足夠的強度、良好的生物相容性及降解性。從制造角度來講，生物打印材料，尤其是涉及到細胞打印時的打印窗口其實很狹窄。為了保證更好的成形精度，材料需要更高的濃度或交聯(lián)密度，而這會對細胞的遷移、增殖等造成很大的影響，同時高濃度的打印材料也會增加打印的難度。然而，低濃度的材料卻難以定形。因而，找到合適的打印材料仍然是生物3D打印技術取得進一步發(fā)展的關鍵要素。從來源上來分，用于生物3D打印的高分子材料可分為合成高分子材料與天然高分子材料。

3.1 合成高分子材料

3.1.1 PEG

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是由環(huán)氧乙烷與水或乙二醇逐步加成聚合得到的一類水溶性聚醚。PEG作為一種兩親性聚合物，既溶于水，又溶于絕大多數(shù)有機溶劑，且其生物相容性好、無毒、免疫原性低，可通過腎排出體外，不會積累在體內，在生物醫(yī)藥領域具有廣泛的應用前景[44-46]。

Gao等[47]使用市售的熱噴墨打印機與PEG-二丙烯酸酯(PEGDA，MW 3400)開發(fā)出了可用于3D軟骨組織工程的生物打印平臺。利用該平臺可以實現(xiàn)人間充質干細胞(hMSC)的精確分布和排列，打印后3D PEGDA水凝膠中的細胞顯示出軟骨形成表型，且在培養(yǎng)過程中糖胺聚糖(GAG)和II型膠原蛋白的產生逐漸增加。構建的工程化軟骨顯示出天然的帶狀組織、理想的ECM組成和適當?shù)臋C械性質。

在另外一項研究中，PEG被用作增塑劑對聚乳酸(polylactic acid，PLA)進行改善[48]。研究者利用三維快速成型技術制備出含5%，10%和20%(質量分數(shù))PEG的PLA / PEG共混物，以及PLA / PEG /活性CaP生物玻璃復合物，并詳細考察了PEG對PLA基共混水凝膠的增塑效果。研究結果表明，PEG的加入會引起聚合物鏈的重排、構建物表面形貌的改變及其潤濕性和彈性模量的增加。此外，添加10%和20%PEG會產生不均勻的3D結構，具有相對較低的機械性能。體外降解研究表明，PEG的加入顯著加速了材料的降解速率。

Tehrania等[49]則用PEG作為增塑劑對納米纖維素膜的打印性能進行了改進。研究發(fā)現(xiàn)，PEG的添加增加了膜在50%相對濕度下的力學強度，也形成了適于印刷的光滑表面。同時，PEG在沒有顯著降低膜的半透明性的前提下增強了膜的保水能力。該膜在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和水中分別表現(xiàn)出600%和超過1000%的溶脹率，表明這些膜可以很好地用作傷口處理敷料。當用含10%和25%PEG的膜孵育成纖維細胞時，未檢測到細胞代謝活性的變化。因此，納米纖維素-PEG膜對人皮膚細胞而言沒有細胞毒性。

3.1.2 PLA

PLA作為一種線型熱塑性脂肪族聚酯，主要是由淀粉原料經過糖化、發(fā)酵及一定的化學反應制備而成。PLA具有很好的生物相容性和生物可降解性，在特定條件下可完全降解，最終產物為二氧化碳和水[50, 51]。除此之外，PLA還具有較好的熱穩(wěn)定性、抗溶劑性，以及優(yōu)異的光澤度、透明性和一定的耐菌性、阻燃性[52]。

因其獨特的性能，PLA被廣泛用于骨組織工程的相關研究中。Ritz等[53]利用3D打印技術制備出PLA圓盤以及多孔籠。多種類型的細胞(成骨細胞、成纖維細胞和內皮細胞)在PLA打印的圓盤上均表現(xiàn)出良好的存活、擴散和增殖。裝載有SDF-1膠原蛋白的PLA籠子則能夠很好地支持內皮細胞的生長并誘導新血管形成。 該研究很好地證明了PLA支架在骨組織工程中的應用潛力。在另外的一篇報道中，研究者利用FDM技術制備出具有不同孔徑的PLA支架，并用于骨組織工程[54]。研究發(fā)現(xiàn)3D打印過程會引起PLA分子量和降解溫度的降低，但沒有改變聚合物的半結晶結構。隨后，研究者將人骨髓基質細胞(hBMSC)接種到打印的支架中，分別培養(yǎng)3 d和7 d后觀察，hBMSC均勻分布在支架內，表現(xiàn)出很高的活性，且與孔徑無關。另外一研究小組則提出基于人牙齦間充質干細胞(hGMSC)復合3D打印PLA支架來改善骨組織再生的新治療策略[55]。研究者詳細評估了3D打印PLA支架(3D PLA)、hGMSC細胞、細胞外囊泡(EV)、聚乙烯亞胺(PEI)以及PEI復合EV(PEI-EV)各要素在骨缺損體內外再生中的作用。研究者共設計了6個實驗組：3D-PLA、3D-PLA+hGMSCs、3D-PLA+EVs、3D-PLA+EVs+hGMSCs、3D-PLA+PEI-EVs、3D-PLA+PEI-EVs+hGMSCs。研究結果表明，3D-PLA+EVs+hGMSCs和3D-PLA+PEI-EVs+hGMSCs均未顯示出細胞毒性，且3D-PLA+PEI-EVs+hGMSCs表現(xiàn)出更高的成骨誘導性。此外，體內實驗結果顯示，植入皮質顱蓋骨組織損傷大鼠中的3D-PLA+PEI-EVs+hGMSCs和3D-PLA+PEI-EVs支架顯示出更好的成骨特性和骨愈合情況。因而，重建骨病變組織的完整性可能是治療意外或手術骨創(chuàng)傷的有效策略。Wang等[56]使用冷大氣等離子體(CAP)改變3D打印支架表面的納米級粗糙度和化學組成，對打印成型的PLA支架進行處理。經CAP處理后，正常3D打印PLA支架的水接觸角從(70±2) (°)急劇下降到(24±2) (°)。X射線光電子能譜(XPS)分析表明，CAP處理后氧與碳的比例顯著增加，表明CAP處理不僅改變了支架的納米級粗糙度，而且改變了化學組成，這對增強骨細胞和MSC的附著和功能起著重要作用。

隨著骨組織工程研究的不斷深入，壓應力在構建組織工程骨中的作用越來越受到重視。Senatov等[57]利用羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)顆粒作為添加劑來增強3D打印PLA多孔支架的力學性能，同時考察了支架在低循環(huán)載荷情況下的表現(xiàn)。利用熔絲擠出3D打印技術，研究者制備了PLA-HAP(15%，質量分數(shù))多孔支架，其平均孔徑和孔隙率分別為700 mm和30%。在循環(huán)載荷試驗中，分散的HAP顆粒能夠降低支架內缺陷的累積速率，抑制裂縫的生長，使支架具有較大抗裂性。PLA-HAP支架能夠在循環(huán)加載21 MPa應力的情況下長時間維持其性能不發(fā)生變化。因而，通過3D打印獲得的PLA-HAP多孔支架有望在循環(huán)載荷作用的情況下用作骨小梁的植入物。

3.1.3 PCL

聚己內酯(polycaprolactone，PCL)又稱聚ε-己內酯，可通過ε-己內酯單體在金屬陰離子絡合催化劑催化下開環(huán)聚合而成，是一種可生物降解的半晶型聚酯材料[58]。PCL無毒，不溶于水，易溶于多種極性有機溶劑，具有良好的生物相容性、良好的有機高聚物相容性以及良好的生物降解性，自然環(huán)境下6～12個月即可完全降解[59-61]。此外，PCL還具有良好的形狀記憶溫控性質，在加熱條件下，表現(xiàn)出良好的粘彈性和流變性，可通過FDM技術進行3D 打印加工[62]。因此，在臨床醫(yī)學研究中，PCL常被用作支架材料，廣泛應用于硬組織工程領域[59, 63]。

3D打印PCL用作組織工程支架時，其機械性能及結構穩(wěn)定性受PCL相對分子質量和支架孔隙幾何構型的影響[32]。研究結果表明，相對分子質量對3D打印PCL支架的壓縮模量和屈服強度有顯著影響。具體而言，相對分子質量為45 000的PCL是制造粘彈性、柔性和承重PCL支架的更可行的選擇。此外，3D打印的PCL支架的孔隙率和機械性能之間存在反向線性關系。為提高骨再生效率，研究者打印出富含磷酸三鈣(TCP)的PCL多孔支架并用于脂肪間充質干細胞(ADSCs)的遞送[64]。結果表明，支架培養(yǎng)的ADSCs較二維(2D)培養(yǎng)的ADSCs具有更高的骨再生效率。TCP的加入對培養(yǎng)在支架中ADSCs成骨分化沒有顯著的貢獻，而3D打印構建的多孔微環(huán)境則在ADSCs的成骨分化中發(fā)揮重要作用。Hollander等[65]則通過FDM 打印技術構建出基于PCL的T形載藥宮內節(jié)育器系統(tǒng)(IUS)。研究者以吲哚美辛為模型藥物，制備出載藥PCL長絲，然后打印出載藥IUS。結果表明，相對于打印前PCL長絲，打印成型IUS的藥物釋放更快，且擴散是該體系藥物釋放的主要機制。該研究表明，3D打印可以為具有控釋功能的植入式裝置的制造開辟新的途徑。

理想的支架不僅需要模仿天然組織的微米結構，它們還需要能夠模仿組織的納米級EMC特性。為了實現(xiàn)這一點，Wang等[66]通過引入石墨烯來改變PCL支架的表面及生物學特性。與純PCL支架相比，石墨烯的添加有助于適度降低材料接觸角，而用5 mol/L NaOH處理會進一步增加支架的親水性，進而使細胞具有更好的附著和更為理想的生物學行為。

同時，為了拓寬PCL在生物3D打印中的應用，通常將其與其它材料進行復合。Peng等[67]使用3種不同比例的PCL與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)混合物制備3D打印支架，并詳細評估了支架的表面特征和降解性質，以及人牙周膜干細胞(hPDLSCs)對支架的反應。結果表明，增加PLGA比例會賦予材料更快的降解速度、更平滑的表面和更強的潤濕性。此外，PLGA的加入可顯著改善hPDLSC在支架上的粘附和增殖，以及更佳的成骨能力。Goncalves等[68]則將HAP和碳納米管(CNT)混合到PCL基質中，并通過3D打印制備復合支架。獲得的支架具有450～700 μm范圍內的方形聯(lián)通孔，含2%CNT(質量分數(shù))支架則是機械性能和導電性的最佳組合。其抗壓強度約為4 MPa，與骨小梁具有很好的相容性，且種植的細胞表現(xiàn)出良好粘附和擴散行為。

3.1.4 PEEK

聚醚醚酮(polyetheretherketone，PEEK)是一種半結晶聚合物，在熔融條件下具有突出的熔體流動性能。同時，PPEK具有十分優(yōu)異的力學性能，與天然骨相似，是一種可用在骨科和牙科中的理想的3D 打印材料[69-71]。同時，PEEK也已被用于外科手術重建、制造解剖模型或患者特異性植入物[72]。

Kang等[73]使用FDM打印技術制造出定制化的PEEK肋骨假體，且該假體的機械行為與天然肋骨的機械行為接近。以天然肋骨骨干的質心軌跡為指導，可以為肋骨假體的形狀和所需強度提供相當大的設計自由度。利用該方法制備的肋骨假體已成功植入患者體內，并取得了良好的臨床表現(xiàn)。Basgul等[74]利用熔融PEEK長絲的方法，3D打印出腰椎融合器標準件。打印融合器的壓縮和剪切強度為傳統(tǒng)機加工融合器的63%～71%，而扭轉強度為92%。打印速度是3D打印PEEK的重要參數(shù)，在3000 mm/min的最高速度下可獲得高達20%的孔隙率，從而降低了打印物的強度。PEEK打印件的結晶度與經擠壓棒加工成的PEEK支架沒有明顯差異。

Wu等[75]將利用FDM技術制備的PEEK樣品與丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)樣品進行了詳細的比較。結果表明，雖然PEEK和ABS的壓縮模量和彎曲模量之間沒有明顯差異，但3D打印PEEK樣品的機械性能(拉伸強度、壓縮強度和三點彎曲強度)高于商業(yè)3D打印機打印的ABS樣品。具體而言，PEEK樣品的拉伸強度、壓縮強度和彎曲強度分別為ABS樣品的108%，114%和115%，即PEEK打印件的機械性能優(yōu)于ABS的3D打印件。為進一步提高PEEK的機械性能，未來的研究可聚焦在提高3D打印系統(tǒng)的控制精度和產品成型精度，減少打印過程中孔的形成以及改善打印層間的粘合。

PEEK作為一種半結晶聚合物，其制造過程中的熱處理條件可以直接和間接地對其結晶度和機械性能產生影響。Yang等[76]利用可控溫的3D打印系統(tǒng)制備PEEK樣品，以研究各種熱處理條件(環(huán)境溫度、噴嘴溫度和熱處理方法)在FDM工藝中，對PEEK的結晶度和機械性能(拉伸強度、彈性模量和斷裂伸長率)的影響。實驗結果表明，通過調控3D打印溫度可以制備出具有不同結晶度和機械強度的PEEK樣品。隨著環(huán)境溫度從25 ℃升高到200 ℃，PEEK樣品的結晶度從17%增加到31%。噴嘴溫度則會影響PEEK晶體熔化、結晶過程、所打印線條之間的界面以及聚合物材料的劣化。打印成型后PEEK樣品的熱處理則可能導致結晶度和結晶過程的差異。相對于回火或淬火處理，爐冷卻或退火可以獲得更高的結晶度(36%和38%)和更好的機械性能。

單純的PEEK為生物惰性材料，具有較差的骨傳導性能，因而PEEK植入物與相鄰骨的不良整合，阻礙其在臨床實踐中的應用。為了改善骨-種植體間的界面效應，通常采用改變其表面特性或用生物活性材料浸漬PEEK的策略。Roskies等[77]通過將PEEK打印物內部結構修改為小梁網(wǎng)絡并用間充質干細胞浸漬PEEK的方法來改善PEEK性能。結果顯示， 3D打印制造的支架孔隙率為(36.38±6.66)%，種植的BMSC和ADSC的形態(tài)類似于附著于支架表面和微孔的活成纖維細胞。兩種細胞均表現(xiàn)出較高的活性，且ADSCs表現(xiàn)出比BMSCs更高的骨分化效率。

在另外一項研究中，研究者[78]通過兒茶酚胺化學反應開發(fā)了一種新型的納米Ag顆粒(AgNPs)修飾3D打印PEEK。SEM照片顯示AgNPs均勻地錨定在PEEK表面上，對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌顯示出顯著的抗菌作用。同時，與純PEEK支架相比，用AgNPs修飾的支架可以很好地支持MG-63細胞的增殖以及更高的堿性磷酸酶活性。因此，這種具有抗菌和促進成骨分化雙功能3D打印PEEK/Ag材料在臨床骨組織修復中具有很好的潛在應用價值。

3.1.5 Pluronic

Pluronic是Poloxamer的一種，為聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物的商品名。Pluronic是一類非離子型高分子表面活性劑，在生物打印中經常被用作犧牲材料，起到初期穩(wěn)定打印構建物或后期形成孔道(形成血管網(wǎng)絡)的作用(圖4)[34, 79]。它具有良好的可打印性和溫度響應凝膠化特性，因而非常適合用作生物3D打印墨水。Pluronic可在4 ℃或更低的溫度下發(fā)生液化，因此，Pluronic凝膠可以在必要時很容易從打印構建物內被沖洗掉[80]。雖然Pluronic已被廣泛用作生物3D打印中的犧牲材料，但其自身的生物相容性不足以支持細胞的長期存活，這也限制了其作為常規(guī)生物打印材料直接用于細胞培養(yǎng)。在最近的一項研究中，Müller等[81]報道了一種構建納米結構Pluronic水凝膠的策略，可以顯著提高Pluronic的生物相容性。該研究中，他們將丙烯酸酯和未經改性的Pluronic F127混合，既可以很好地保持Pluronic的可打印性又可通過UV交聯(lián)獲得穩(wěn)定的3D凝膠結構。隨后經洗脫將未反應的Pluronic從交聯(lián)網(wǎng)絡中除去。經14 d的培養(yǎng)后，所裝載軟骨細胞的存活率從純丙烯酸化Pluronic水凝膠體系中的62%提高至納米結構水凝膠中的86%。洗脫除去納米結構水凝膠體系中未反應的Pluronic會導致3D結構的孔隙率增加，機械強度低，但是可以通過添加丙烯酸甲酯透明質酸(HAMA)來進行改善。這些結果表明Pluronic可以潛在地與其它聚合物結合并用于不同組織構建體的生物打印。

圖4 Pluronic作為犧牲材料構建孔道結構：利用 Pluronic 構建的1D(A)、2D(B)和3D(C)孔道結構的示意圖、光學照片及熒光照片；灌注HUVECs細胞后的2D孔道結構的光學照片(D)及激光共聚焦照片(E)[34, 79]Fig.4 Vasculature developed by using Pluronic as sacrificial material: schematic illustrations, optical images and fluorescent images of printed 1D (A), 2D (B) and 3D (C) vascular networks; Optical image of representative micro-channel within a 2D vascular network perfused with a HUVEC suspension (D) and confocal image of live HUVEC cells lining the microchannel walls (E) [34, 79]

3.2 天然高分子材料

3.2.1 膠原

膠原(collagen)是動物組織最主要的構造性蛋白質，同時也是ECM最重要的組成成份。由于膠原具有很低的免疫原性、良好的生物相容性及可生物降解性，而被廣泛應用于組織工程與再生醫(yī)學等領域。Koch等[82]使用Ⅰ型膠原負載角質形成細胞和成纖維細胞，并利用激光輔助生物3D打印(LaBP)技術成功構建出多層三維皮膚組織。研究發(fā)現(xiàn)，打印成型后兩種細胞之間存在胞間通訊，所得到的皮膚構建物也具有組織特異性功能，這為進一步構建復雜的多細胞組織結構奠定了基礎。在另一項研究中，研究者[83]利用膠原模擬真皮基質負載角質形成細胞和成纖維細胞，通過逐層打印的方式構建出仿表皮和真皮結構的多層皮膚組織。將打印出的三維皮膚構建體在培養(yǎng)基內浸泡培養(yǎng)后，將表皮層暴露于氣-液界面處以促進打印皮膚組織的成熟和分層。組織學和免疫熒光結果表明，3D打印的皮膚組織在形態(tài)學和生物學上與天然人體皮膚組織相似，可很好地用作皮膚病生理學研究模型。

Rhee等[84]利用高密度膠原水凝膠通過商業(yè)3D打印機成功打印出非均相半月板結構，并詳細考察了打印物的結構精準性、力學穩(wěn)定性和細胞活性。結果表明，對打印沉積表面進行適當加熱可極大地提高打印產物的幾何精度。當膠原水凝膠濃度為15和17.5 mg/mL時可得到最佳的半月板結構，且其壓縮模量隨著膠原濃度線性增加，然而打印細胞活性卻與膠原凝膠濃度無關。打印成型的半月板結構在體外培養(yǎng)中，可保持其幾何形狀及細胞活性達10 d。

天然組織/器官具有復雜的分級多孔結構，以賦予細胞高度特異性的功能。但模仿大多數(shù)天然組織/器官的分層多孔膠原結構仍然是非常具有挑戰(zhàn)性的。為此，Ng等[85]提出了單步按需滴定(DOD)生物打印策略來制造分層多孔膠原基水凝膠，以通過改變膠原原纖維形成過程來調控多層膠原基水凝膠內的孔隙。實驗結果表明，通過調控打印在每層上的膠原生物墨水滴的數(shù)量，即可以實現(xiàn)分級多孔膠原結構的構建。這種簡便的單步生物打印方法為各種組織工程膠原基水凝膠結構的構建提供了新途徑。

天然ECM組分復雜，為比較不同組分對細胞生長發(fā)育的影響，Park等[86]將膠原與透明質酸進行了詳細的對比。他們發(fā)現(xiàn)這兩種ECM組分，相較于非天然材料水凝膠，都能夠更好地促進細胞增殖和細胞功能，但透明質酸對于軟骨細胞表現(xiàn)出更好的促進作用，而膠原則更有利于成骨細胞的培養(yǎng)。因此，選擇適當?shù)乃z材料，對于生物打印構建組織/器官至關重要。

在另一項研究中，膠原被制成可滿足打印機噴嘴要求的微纖維(長度為(22±13)μm)[87]，然后利用膠原結合結構域(CBD)負載骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP2)，并混合到甲基丙烯酰胺化明膠內進行載細胞打印。結果表明，打印材料內加入的CBD-BMP2-膠原微纖維在14 d培養(yǎng)期內比成骨培養(yǎng)基更能有效地誘導所負載的BMSC向成骨細胞分化。

另外，膠原還被廣泛用作生物打印中的生物紙，即首先打印出類似于標準印刷工藝中紙的作用的膠原底物，通常為膠原水凝膠，然后將負載有細胞的生物墨水或單純的細胞或細胞聚集體打印在膠原底物表面進行三維結構構建[88, 89]。

3.2.2 明膠

明膠(gelatin)是膠原經部分水解而得到的一類蛋白質，與膠原具有同源性，具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和低抗原性。明膠溶液具有溫度響應性，可在低溫環(huán)境下凝膠化(凝膠化具有濃度依賴性)。因而，不同濃度的明膠及其與其它高分子材料的混合物已被用在生物3D打印中。同時，明膠的改性產物，如光反應性甲基丙烯?；髂z(gelatin methacryloyl, GelMA) 也常被用于生物3D打印。

Zhang等[90]利用明膠-藻酸鹽復合材料包裹成肌細胞并研究了利用該材料生物打印軟組織結構的機械性能。該打印過程包括兩步交聯(lián)程序：生物打印過程中明膠在低溫下的物理交聯(lián)和生物打印完成后藻酸鹽與Ca2+的離子交聯(lián)。研究者觀察到在培養(yǎng)期間載有細胞的構建體的機械強度會降低，但結構的低孔隙率和成角度的幾何形狀能夠維持它們的機械耐久性。同時，盡管細胞活性由于低溫影響在打印后最初幾天急劇下降，但隨著培養(yǎng)時間增加細胞仍會繼續(xù)增殖。在另一項研究中，明膠-藻酸鹽復合材料被用于生物打印構建硬組織結構[91]。研究表明，人類骨肉瘤細胞在這種復合生物基質中呈現(xiàn)出非增殖狀態(tài)。因此他們提出利用瓊脂糖覆蓋物填充打印成型的硬組織構建體。此外，研究者還在體系中添加了多磷酸鹽-Ca2+復合物以更好地促進礦物沉積。該復合體系顯著改善了載細胞構建體的機械性能及細胞增殖活性。

LaBP技術目前也正被廣泛用于3D生物打印，然而打印質量有待進一步提高。Xiong等[92]利用明膠作為LaBP的能量吸收層(EAL)材料，考察了其在生物3D打印中的可行性。在該研究中，明膠EAL被施加在石英支撐體和待打印的構建材料涂層(海藻酸鹽)之間。由于明膠凝膠的吸收系數(shù)較高，特別是在達到最佳打印類型/質量時，所需的激光能量密度也會降低。結果表明，打印后細胞活力提高了10%，DNA雙鏈斷裂減少了50%。同時，明膠EAL還有助于降低打印材料的液滴尺寸和平均射流速度。

明膠具有熱響應性，因而可以通過溫度變化來使其凝膠化以維持所打印結構的形狀。然而，溫度誘導的凝膠化通常是緩慢且不穩(wěn)定的。為了解決這一問題，可采用光反應性甲基丙烯?；鶎γ髂z進行改性，并在溫和的條件下利用光引發(fā)劑通過紫外光照射對其進行共價交聯(lián)。這種甲基丙烯?；拿髂z，即GelMA，是一種很有應用價值的生物材料，它在甲基丙烯酰基活化期間或光引發(fā)聚合過程中，可以很容易地控制交聯(lián)密度，進而調控最終打印構建物的物理化學性質[88, 89, 93-95]。Bertassoni等[96]報告了一種基于擠出式生物打印機打印載細胞GelMA 生物墨水的策略。研究者通過探討各種GelMA和細胞濃度以及不同的UV照射時間來評估載有細胞的GelMA的可打印性。使用10% GelMA 可獲得良好的打印構建物，且UV照射時間在15 到 60 s之間時對細胞無顯著性影響。同時，該課題組通過引入可犧牲瓊脂糖，3D打印出基于GelMA的含微通道網(wǎng)絡的構建體。在去除這些犧牲層后，可顯著改善打印構建物內的質量轉運，提高細胞活性以及GelMA基質中成骨細胞的分化。

Liu等[97]利用GelMA的剪切稀化和自愈合性能，通過簡單冷卻過程實現(xiàn)了載細胞GelMA的物理凝膠打印成型。GelMA可以在物理凝膠后保持形狀并形成整體結構，通過隨后的UV光照交聯(lián)實現(xiàn)永久穩(wěn)定。該方法可以使GelMA能夠在相對低濃度(低至3%)下直接打印成型為高度多孔和柔軟的結構，同時能夠維持細胞較高的增殖、遷移活性。

Kolesky等[79]報道了一種以GelMA為主要基質材料、利用多噴頭沉積系統(tǒng)(MHDS)同步打印多種細胞的方法。打印過程中，為了構建血管網(wǎng)絡，研究者使用Pluronic F127作為犧牲油墨，在打印完成后通過較低溫度液化處理將其除去。該MHDS體系大大減少了構建復雜組織結構所需的打印時間，并且能夠維持包封在GelMA中的多種細胞高存活率。

另外，GelMA也被用于金屬(例如金屬鈦)表面修飾。由于其相對低的抗原性和高耐久性，金屬鈦已廣泛地用在生物醫(yī)療中。然而，由于鈦和組織之間的界面效應，阻止了足夠的負荷傳遞到植入物周圍的骨中。隨著時間的推移，承重植入物會趨于松動并需要進行手術翻修。因此，為了改善鈦植入物與骨的整合，McBeth等[98]利用擠出式生物3D打印機制備出GelMA支架，并直接打印并接枝到鈦植入物表面。結果表明，在沒有任何外源性成骨因子的情況下，該支架能夠觸發(fā)MG63成骨細胞和原代正常人成骨細胞的礦物質沉積，可有望成為良好的鈦植入物替代品。

用甲基丙烯?；倌軋F改性明膠，并通過光引發(fā)自由基聚合反應進行后加工固化，所產生水凝膠是由長度不可控且不可降解的聚合物鏈交聯(lián)而成。為克服這一缺點，Bertlein等[99]開發(fā)出了一種烯丙基化明膠材料(GelAGE)，可通過硫醇-烯點擊化學二聚化反應而固化。該凝膠化過程產生的分子網(wǎng)絡具有柔性特性，可提供比甲基丙烯?；鼜V泛的生物制造窗口，且該反應沒有產生額外的不可降解組分。通過基于光刻(數(shù)字光處理)3D打印技術和擠出生物3D打印技術，利用GelAGE可制備出具有高形狀保真度的結構(圖5)，且擠出式生物3D打印GelAGE可維持所打印的軟骨細胞的長時間存活。

圖5 可打印明膠的制備：(a)甲基丙烯酰化明膠(GelMA)及烯丙基化明膠(GelAGE)的合成示意圖；(b)GelMA及(c)GelAGE的光固化機理示意圖[99]Fig.5 Preparation of printable gelatin: (a) Scheme of the synthesis of GelMA and GelAGE, (b) the free radical polymerization of GelMA, and (c) the controlled dimerization with thiol-ene click chemistry for GelAGE[99]

3.2.3 海藻酸

海藻酸(alginate)，又稱為海藻酸鹽，是從褐藻中提煉出的一種陰離子天然多糖，與人體天然ECM中的糖胺聚糖類似。海藻酸具有低細胞毒性及良好的生物相容性，因而在生物醫(yī)學中得到了廣泛的應用。同時，由于其可在溫和的生理條件下快速膠凝化而不會產生有害的副產物，因而被廣泛用作生物打印材料。

在多價陽離子與海藻酸形成的水凝膠中，以Ca2+-海藻酸水凝膠研究的最多。例如，Yu等[100]設計出一種同軸噴嘴系統(tǒng)，通過護套擠出藻酸鹽溶液，并在芯中輸送CaCl2溶液，以此打印出管狀結構。隨后，他們將軟骨祖細胞包裹在藻酸鹽中，并通過該同軸噴嘴系統(tǒng)打印出具有良好機械性能和生物學特性的載細胞中空管狀構建體。同時研究發(fā)現(xiàn)，將藻酸鹽濃度從2%增加至6%(w/v)時，由于粘度增加導致擠出剪切應力增加，進而顯著降低了細胞活性。在另一項研究中，Zhang等[101]將人臍靜脈平滑肌細胞((HUVSMCs)裝載在海藻酸鹽中，同樣使用同軸噴嘴打印方法構建脈管系統(tǒng)導管。研究者除了考察細胞的活性及ECM沉積，還探討了構建體的脫水、溶脹和降解特征。研究表明在生物打印導管的兩個表面上都觀察到ECM形成；較高濃度的藻酸鹽會導致較低的細胞活性、降解速率、孔隙率和滲透性，而4%藻酸鹽濃度表現(xiàn)出最佳的生物打印特性。同樣，Gao等[102]使用相同的同軸系統(tǒng)對藻酸鹽基生物墨水進行3D打印以制造空心管結構(圖6)。初步成型后，他們采用分階段逐漸浸入CaCl2溶液中的方法對打印構建物進行進一步的交聯(lián)，該方法對于實現(xiàn)大規(guī)模生物打印或大尺寸組織打印構建具有重要意義。

除了被廣泛用在擠出式生物打印中，海藻酸還可以作為生物墨水用在LaBP過程中[103]。一個典型打印方法是，將載細胞海藻酸生物墨水涂敷在具有激光吸收層的石英片表面，然后將激光聚焦在石英片的頂部，其光學吸收層將產生局部加熱并在下面的細胞-海藻酸涂層中產生蒸汽泡。然后氣泡膨脹并迫使海藻酸形成液滴，隨后噴射到CaCl2溶液中。在LaBP過程中，凝膠特征參數(shù)和海藻酸濃度將影響細胞活性。結果表明，噴射到CaCl2溶液中的海藻酸液滴經2 min凝膠化后，所裝載的細胞活性高于經10 min凝膠化處理的細胞，表明載細胞海藻酸較厚凝膠層會阻止氧氣和營養(yǎng)物質的運輸。研究者進一步考察了海藻酸濃度對細胞活性的影響，他們發(fā)現(xiàn)由于傳質的局限性，高濃度海藻酸導致低細胞活性。另一研究組采用相似的LaBP技術考察了海藻酸粘度的影響[23]。高粘度海藻酸可通過提高其濃度而獲得，并可以用來打印具有更小直徑的液滴，提高打印結構的分辨率。由此可以看出，細胞活性和結構分辨率似乎存在相互平衡的作用。因此，為滿足不同的應用需求，需要精確調控海藻酸濃度。

圖6 海藻酸基空心管結構的3D打印制造：(a)多層海藻酸空心管結構的3D打印成型過程示意圖；(b)制備的單根海藻酸空心管；(c)打印成型具有空心結構的海藻酸圓柱體、網(wǎng)格、長方體及半球體[102]Fig.6 Fabrication process of a 3D alginate structure with built-in microchannels: (a) Scheme of the fabrication process; (b) Printed alginate hollow filaments; (c) Printed 3D alginate hollow cylinder, grid, cuboid and hemispheroid[102]

同樣，Gasperini等[104]通過使用電流體動力學沉積方法將載有細胞的海藻酸微粒打印到明膠-CaCl2涂層上。在該方法中，生物打印機噴嘴的尖端連接到具有高電壓的電脈沖發(fā)生器，用于克服分配器的尖端處發(fā)生的表面張力相關問題。在另一項研究中，Williams等[105]利用藻酸鹽，通過使用基于液滴的生物打印方法對脂肪組織中血管基質部分(SVF)的細胞聚集體進行打印。他們發(fā)現(xiàn)包封的細胞均勻地分散在海藻酸構建體中并保持良好的細胞活性。

由含海藻酸制成的生物墨水也可通過噴墨生物打印技術來制造復雜的結構[106]?？傊捎谄渚哂锌焖傥锢砟z化和廣泛可調粘度的能力，海藻酸已成為廣泛使用的生物打印天然聚合物。然而，海藻酸是相對生物惰性的材料，具有有限的細胞附著能力。為了解決生物打印應用的這個問題，Jia等[107]在氧化步驟后，它們將RGD肽綴合到海藻酸上使其具有生物活性和細胞結合位點。

3.2.4 透明質酸

透明質酸(hyaluronic acid，HA)是天然ECM中的一種非硫酸化糖胺聚糖，以其獨特的分子結構和理化性質在機體內顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節(jié)，調節(jié)血管壁的通透性，調節(jié)蛋白質、水電解質擴散及運轉，促進創(chuàng)傷愈合等。尤為重要的是，HA具有特殊的保水作用，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保濕性最好的物質，被稱為理想的天然保濕因子。溶于水后，HA溶液具有粘性，且其粘度會隨濃度和相對分子量增加而增加。同時，研究表明當剪切速率增加時，HA分子需要更長的弛豫時間才能重新定向，表現(xiàn)出粘度降低效應，從而使其非常適合用作需要高粘度和良好流變性的生物3D打印材料。

Park等[86]在一項研究中為構建骨軟骨界面，用PCL作為支撐物打印出兩個矩形部分：一部分是由海藻酸-HA混合水凝膠裝載軟骨細胞/成骨細胞打印而成，而另一部分則是由I型膠原負載軟骨細胞/成骨細胞打印而成。研究結果表明，I型膠原水凝膠中的成骨細胞具有超過90%的活性，并且比海藻酸-HA水凝膠中的成骨細胞顯示出更高的成骨標記物(RUNX2和ALP)表達；而在海藻酸-HA水凝膠內培養(yǎng)的軟骨細胞則比I型膠原水凝膠中的細胞顯示出更高的軟骨細胞標記物(II型膠原和聚集蛋白聚糖)表達水平。這意味著不同的細胞需要不同的打印基質材料才能更好地發(fā)揮其作用。

Law等[108]則制備出HA與甲基纖維素(MC)的復合水凝膠(HAMC)，并用于生物3D打印。他們詳細評估了8種濃度的HAMC的可打印性、溶脹性、流變特性、經時結構穩(wěn)定性以及所裝載間充質干細胞的活性。結果表明，HAMC混合溶液在4 ℃時表現(xiàn)為粘性，通常達到37 ℃時凝膠化，并且在較高溫度下具有較快的膠凝化速度?；旌纤z的儲存、損失和壓縮模量等可調控，且與HAMC濃度及37 ℃時的溫育時間有關。膨脹性和穩(wěn)定性受時間比受pH環(huán)境的影響更大。細胞實驗表明，3D打印結構中間充質干細胞活性高于75%，在打印后存活時間至少一周，且較高濃度的HAMC更加適合細胞的3D打印。

與明膠類似，光反應性HA，如甲基丙烯酸化HA(MeHA)也被開發(fā)出來并用于生物3D打印。Duan等[109]人基于MeHA和GelMA開發(fā)出了物理性質可調節(jié)的混合水凝膠，并用于生物打印載有人主動脈瓣膜間質細胞的心臟瓣膜導管(HAVIC)。該混合水凝膠可以很好地支持HAVIC生長并可以通過改變混合水凝膠成分來調節(jié)細胞應答。增加GelMA濃度會導致水凝膠硬度降低、粘度增大和細胞粘附密度增加，從而促進HAVIC擴散和更好地維持HAVIC的成纖維細胞表型。打印精確度則取決于GelMA和MeHA的相對濃度，經水凝膠組分優(yōu)化后則可打印出具有高細胞活性、良好準確性和重塑潛力的活體三葉草心臟瓣膜導管。

在另外一篇報道中，研究者[110]將MSCs裝載到MeHA水凝膠中，培養(yǎng)21 d后細胞存活率保持在64.4%。在沒有額外成骨刺激的情況下，MSCs的成骨分化在高濃度MeHA水凝膠中自發(fā)發(fā)生。向培養(yǎng)基中添加骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)，進一步增加了成骨分化效率。同時，流變學和動態(tài)力學分析表明，UV照射使得MeHA水凝膠的存儲模量和彈性模量增加，即水凝膠強度增加，使其非常適用于生物3D打印。

3.2.5 其它天然高分子材料

葡聚糖(dextran)是指以葡萄糖為單糖組成的同型天然多糖，單元之間以糖苷鍵連接，又稱右旋糖酐。因其無毒性和親水性而廣泛用于組織工程。 Pescosolido等[111]利用HA和羥乙基甲基丙烯酸化葡聚糖(dex-HEMA)制備出具有多糖半互穿網(wǎng)絡的聚合物水凝膠。經光反應交聯(lián)后，該凝膠具有良好的粘彈性和假塑性，且其機械性能與天然組織的機械強度具有很好的匹配性。同時，研究者利用該水凝膠體系裝載馬軟骨細胞進行3D打印，成型后的軟骨細胞具有優(yōu)異的生物學活性。在另一項研究中，Du等[112]基于熱敏明膠和氧化葡聚糖之間的相分離機制研發(fā)出可在生理pH范圍內調控其凝膠時間的水凝膠。兩相體系的交聯(lián)動力學可以在pH 6.0～8.0的生理環(huán)境范圍在1 h內有效地調節(jié)。結合熱敏明膠的可擠出性，隨后的席夫堿反應可使水凝膠非常容易地自發(fā)交聯(lián)成型。因而，該水凝膠的易處理性、熱敏物理凝膠特性和延遲的化學交聯(lián)增強作用，使其成為很好的生物3D打印材料。

瓊脂糖(agarose)是一種線性結構的多糖，基本結構是1,3連結的β-D-半乳糖和1,4連結的3,6-內醚-L-半乳糖交替連接起來的長鏈。瓊脂糖在水中一般加熱到90 ℃以上溶解，溫度下降到35～40 ℃時形成良好的半固體狀的凝膠，這是它能夠用于生物3D打印的主要特征基礎。Kreimendahl 等[113]將瓊脂糖分別與I型膠原和纖維蛋白混合，制備出用于生物3D打印復合水凝膠并考察了其誘導血管形成的能力。研究發(fā)現(xiàn)，膠原和纖維蛋白的加入對最終打印分辨率沒有顯著性影響，而瓊脂糖-膠原混合水凝膠的儲存模量與相應的單一組分相比顯著提高。通過裝載人臍靜脈內皮細胞和人皮膚成纖維細胞，打印成型并孵育14 d后，在瓊脂糖-I型膠原復合水凝膠中觀察到明顯的毛細血管網(wǎng)形成。Fan等[114]則基于基質膠(Matrigel)-瓊脂糖研發(fā)出具有生物打印所需流變特性的復合水凝膠體系，用于生物3D打印人腸上皮細胞(HCT116)。該混合水凝膠的彈性隨膠凝時間延長而增加，但當Matrigel的體積分數(shù)增加時，凝膠彈性降低。經優(yōu)化后具有50%(體積分數(shù))Matrigel和3%(質量分數(shù))瓊脂糖的混合水凝膠表現(xiàn)出最好的可打印性，且能夠很好地支持細胞粘附和生長。此外，當在恒定溫度(37 ℃)下進行打印時，細胞鋪展和細胞活性都得到顯著改善。在最近的一篇報道中，研究者[115]利用瓊脂糖、鋰皂石(Laponite)和原位聚合丙烯酰胺(PAM)制備出4D打印水凝膠(4D凝膠)。在該復合體系中Laponite賦予水凝膠剪切稀化特性及打印后形狀穩(wěn)定性，而高度交聯(lián)的瓊脂糖網(wǎng)絡則滲透到輕度交聯(lián)的PAM網(wǎng)絡中，賦予4D凝膠高強度和韌性。同時，瓊脂糖的溶膠-凝膠熱可逆性則賦予水凝膠的第四維變化的能力。研究結果表明，該4D凝膠的機械性能出乎意料地高于瓊脂糖和聚丙烯酰胺水凝膠的機械性能，且顯示出可進一步轉變其形狀的能力。研究者通過噴墨打印技術成功構建出能夠張嘴和翹尾的水凝膠鯨魚和揮動觸角的水凝膠章魚。這項工作對于構建更為復雜的結構提供了新途徑，在開發(fā)智能支架、傳感器、軟體機器人等研究中具有重要借鑒意義。

殼聚糖(chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(chitin)經過脫乙酰作用而得到。自1859年，法國人Rouget首先得到殼聚糖后，這種天然高分子的生物功能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關注。Wu等[116]報告了一種直接在室溫條件下用殼聚糖打印構建復雜三維結構(如星形薄片、葉子和蜘蛛狀等，如圖7)的方法，并詳細考察了影響打印過程的各因素，包括墨水特性(即流變性質和溶劑蒸發(fā))、打印工藝參數(shù)(即噴嘴直徑、施加的壓力和推進速度)等。結果表明，在酸性條件下制備的殼聚糖墨水在打印成型后會有殘留的酸，這將有助于減少由收縮引起的形狀變形。中和處理后，打印的三維結構仍然能保持其形狀。在另外一項研究中，研究者報道了一種可自動化、高效、低成本3D打印制備具有可控孔隙率的殼聚糖支架的方法[117]。該方法依賴于專門的3D打印系統(tǒng)，可以實現(xiàn)很好地重建宏觀和微觀級別的復雜結構，同時提升對支架幾何形狀的有效控制。研究者制備出的殼聚糖支架具有400 μm開放網(wǎng)狀幾何形狀，為人成纖維細胞粘附和增殖提供了條件。

圖7 基于殼聚糖的復雜三維結構打印構建：(a)3D打印成型過程示意圖；(b)打印成型的殼聚糖支架的俯視及側視SEM照片；(c～e)打印成型的殼聚糖星形薄片、葉子和蜘蛛狀結構的熒光照片[116]Fig.7 3D printing of complicated microstructures using chitosan: (a) Schematic of the 3D printing process; (b) SEM image of a 3D chitosan scaffold with square pore size with top and side views; (c～e) Fluorescent microscopy images of 3D printed starfish, leaf and spider structure[116]

纖維蛋白原(fibrinogen)是一種由肝臟合成的可溶性糖蛋白，在Ca2+存在下通過凝血酶的分子間相互作用轉化為不溶性纖維蛋白分子，參與血液凝塊形成。纖維蛋白原具有很好的生物相容性、可生物降解性和非免疫原性，可誘導細胞附著、增殖和形成ECM[118-120]。Nakamura等[38]使用纖維蛋白和海藻酸鹽制作生物墨水并用于細胞3D打印。在該生物墨水體系中，纖維蛋白具有很好的細胞相容性，而海藻酸鹽則是用作打印成型材料很好的選項。Xu等[121]利用纖維蛋白-膠原蛋白，并將噴墨印刷與靜電紡絲結合起來，以改善用于軟骨組織工程的最終構建體的性能。在該研究中，PCL靜電紡絲與負載軟骨細胞的纖維蛋白-膠原水凝膠3D打印交替進行，制造出厚約1 mm的五層組織構件。結果表明，與單獨打印的海藻酸或纖維蛋白-膠原凝膠相比，該構建體表現(xiàn)出增強的機械性能。同時，軟骨細胞在該構建體成型一周后的存活率仍超過80%，并能夠很好地維持其增殖及其它生物學特性。

圖8 蠶絲蛋白用于生物3D打?。?a)蠶絲蛋白的甲基丙烯酸化處理(Sil-MA)示意圖；(b，c) 利用Sil-MA打印成型的腦、耳、氣管、心臟、肺和血管結構[122]Fig.8 3D printing using silk fibroin: (a) Modification of silk fibroin molecule with GMA; CAD and images of printed brain and ear (b), and trachea, heart, lung and vessel at different conditions (c) [122]

3.3 脫細胞細胞外基質材料

ECM是由細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面以及細胞之間，主要是由一些蛋白、多糖和蛋白聚糖組成[40, 125-127]。在生物體內，這些分子自發(fā)形成復雜的網(wǎng)架結構，起到支持并連接組織結構、調節(jié)細胞行為和組織發(fā)生的重要作用。脫細胞細胞外基質(decellularized ECM, dECM)材料是指通過使用化學試劑或采用物理、機械作用處理等方法，除去組織或器官的細胞成分，僅保留細胞外基質成分的一類材料[39, 41, 128, 129]。理想的dECM材料應完全去除組織內所有細胞、病毒等成分，而最大限度地保留天然細胞外基質的成分和三維結構。

在生物3D打印研究中，為了更好地模擬體內真實微環(huán)境，dECM也被用于組織特異性新型生物墨水的開發(fā)。Pati等[35]開發(fā)了基于dECM的生物墨水，以達到體外重構細胞天然微環(huán)境、維持細胞固有形態(tài)和功能的目的。在該研究中，研究者通過物理、化學和酶處理聯(lián)用的方法成功地獲得了脫細胞心臟(豬源，hdECM)、軟骨(豬源，cdECM)和脂肪(人源，adECM)細胞外基質。得到的dECM細胞去除率達98%以上，而每mg hdECM、cdECM和adECM內DNA殘余量僅分別為11±1、6.7±1.2和 39±15 ng。隨后，制備的dECM被用作生物3D打印墨水，其打印過程如圖9所示。預凝膠化的hdECM被直接用于打印構建心臟組織結構。軟骨和脂肪組織結構，則是利用多噴頭打印技術同時擠出dECM和PCL而制得。其中，PCL作為骨架起到支撐作用。進一步體外實驗表明，dECM用于細胞打印能夠有效維持高細胞存活率、支持細胞特異性基因表達和ECM形成，為解剖學相關(厘米級)尺寸組織的體外構建提供可能性。

Skardal等[130]利用Triton X-100處理獲得了骨骼肌、肝臟和心臟組織dECM。然后將dECM與基于透明質酸/明膠的水凝膠溶液混合并用于生物3D打印。該水凝膠打印墨水，可通過4臂和8臂PEG二丙烯酸酯(PEG-DA)提供的丙烯酸酯基與硫醇化透明質酸或硫醇化明膠提供的硫醇基團反應，實現(xiàn)第一次交聯(lián)反應。在第一交聯(lián)步驟之后，利用UV光照射進行二次交聯(lián)以形成穩(wěn)定的水凝膠結構。同時，為了驗證生物打印肝臟結構的功能性，研究者在水凝膠預聚物溶液中加入原代人肝細胞聚集體。

圖9 利用脫細胞心臟(豬源，hdECM)、軟骨(豬源，cdECM)和脂肪(人源，adECM)細胞外基質3D打印組織結構的流程示意圖[35]Fig.9 Schematic elucidating the tissue printing process using decellularized heart (hdECM), cartilage (cdECM) and adipose (adECM) extracellular matrix[35]

結果表明，打印成型的肝組織結構具有較高的細胞活性，且細胞可以產生達到可檢測水平的白蛋白和尿素。

在最近的一篇報道中，Athirasala等[131]通過將海藻酸鹽(3%)水凝膠與牙本質基質的可溶性和不溶性成分混合，開發(fā)出了一種新型可打印生物墨水材料。研究者發(fā)現(xiàn)，含有較高濃度的海藻酸鹽可提高所制備生物墨水的打印成型性，而含較高比例牙本質不溶性基質成分的生物墨水則可顯著提高細胞活力。其中，海藻酸鹽和牙本質的比例為1∶1時，最適合用作生物3D打印墨水。此外，在濃度為100 μg/mL時，這些可溶性牙本質基質成分可顯著增強所包裹干細胞的牙源性分化。

基質膠(matrigel)作為一種商品化的ECM提取混合物，從小鼠肉瘤ECM中提取獲得，其組分包括一些必需的生物活性分子，如層粘連蛋白、膠原蛋白和生長因子。它可作為天然仿生ECM，可在較高溫度下進行熱交聯(lián)，目前已被廣泛用于細胞和組織培養(yǎng)。Poldervaart等[37]利用Matrigel與海藻酸混合制備生物3D打印墨水，以用于血管化研究。與其他研究結果類似，添加海藻酸可以改善基質膠的可打印性。他們還將血管內皮生長因子(VEGF)直接或以微球包裹的方式放入，從而實現(xiàn)其控制釋放。同時，他們使用帶有氣動驅動系統(tǒng)的生物3D打印機對負載人類內皮祖細胞(human endothelial progenitor cells, EPC)的生物墨水進行打印。結果表明，海藻酸的添加可改善生物墨水的可打印成型性，但同時生物墨水的降解速率增加，管狀結構的形成速率降低。這意味著材料類型及其比例是開發(fā)最佳生物打印材料的關鍵參數(shù)。 Matrigel還可作為微流體系統(tǒng)的一部分用于生物打印藥物平臺構建，以及作為生物紙用于材料表面涂覆以起到支持所打印的細胞存活及功能維持的目的[23, 132]。然而，對于Matrigel，其最主要的問題是它源自鼠肉瘤ECM，這也極大地限制了其臨床適用性[133]。

4 結 語

生物3D打印作為3D打印技術最前沿的研究領域之一，是生命科學、材料科學、制造科學交叉融合的新興領域。通過將生物材料、活細胞和活性因子等一體化成型而制備具有精確的解剖結構與特定的生物學功能的組織/器官，有望為組織/器官再生、臨床修復治療、器官移植、藥物研發(fā)等醫(yī)學應用帶來全新的理論和方法突破。目前，利用生物3D打印技術人們已成功構建出幾種接近臨床需求的功能性組織，但總體而言該領域仍處于早期階段，仍然面臨著許多挑戰(zhàn)。就生物3D打印材料而言，隨著研究的深入，支持高精度快速成型、具有特異性生物學功能且與打印機及打印軟件具有更好的兼容性的新型材料應當不斷地被開發(fā)出來。

人體組織器官無論是從結構上還是從功能上來講，都是極其復雜的。材料在體外打印構建組織器官時，需起到保護支撐、維持活性、誘導分化、引導新生以及促使功能成熟等多重功能。因此，任何單一組分的材料都不可能兼具重構組織功能所需的所有特性。因此，開發(fā)復合3D打印材料成為一個必然的趨勢。例如，Kang等[34]開發(fā)出一種集成式組織器官打印機(integrated tissue-organ printer, ITOP)，并以明膠、纖維蛋白原、透明質酸和甘油為材料基礎，通過調控不同組分的比例，制備出分別用于骨、軟骨、骨骼肌打印的生物墨水(圖10a和10b)。同時，以Pluronic F-127為外層犧牲，以PCL為力學增強材料，成功構建出下頜骨、軟骨(耳)和骨骼肌(圖10c～10e)。Zhang與Khademhosseini等[134]率先報道了多細胞/材料體系的仿生打印技術，在體外構建了與人體器官類似的人工組織器官(圖11)。利用高度自動化控制的多材料打印機，實現(xiàn)了對7種“生物墨水”的快速打印，分別構建了類器官結構如腦、肺、心臟、腎、胰腺、胃、小腸、大腸、膀胱、前列腺等器官。例如，以GelMA和海藻酸鹽水凝膠為基質，包覆多種細胞，在保障細胞存活率的前提下，成功地打印了類心臟結構，細胞初始存活率達到90%以上，培養(yǎng)7 d后顯示出顯著的分化特性，預示其在組織再生方面具有很大的潛力。

圖10 生物3D打印構建大尺度類人體器官：(a)研究者開發(fā)的名為“integrated tissue-organ printer (ITOP)”的打印機的示意圖；(b)打印物結構示意圖；(c～e)生物3D打印成型的下頜骨、軟骨(耳)和骨骼肌[34]Fig.10 Fabrication of stable, human-scale tissue constructs of any shape: Illustration of the integrated tissue-organ printer (ITOP) (a) and the basic patterning of 3D architecture including multiple cell-laden hydrogels and supporting PCL polymer (b); Reconstruction of mandible bone (c), ear cartilage (d) and skeletal muscle (e)[34]

為更好地維持打印細胞的活性，實現(xiàn)組織器官功能的體外重建，仿生學的重要意義被逐漸彰顯出來。未來一個重要的發(fā)展方向就是對天然ECM的認識不斷深入，通過模擬ECM的復雜組分及梯度分布，開發(fā)具有特異性功能的活性材料(如活性因子或dECM修飾后的高分子材料)；同時利用3D打印技術精準調控功能性材料的呈現(xiàn)，實現(xiàn)特異性ECM的體外復制，構建出仿ECM的微環(huán)境，為細胞的生存、增殖、分化及功能維持創(chuàng)造有利條件?；诜律鷮W的另外一個重要研究方向則是開發(fā)功能適應性材料，即材料可以自發(fā)地根據(jù)外部刺激按需重新編程其形狀、屬性或功能。比如，在打印初期材料除了能夠起到保護支撐的作用，還應能促使細胞產生并沉積ECM，自發(fā)構建出適合細胞自身生長的微環(huán)境；隨著細胞的不斷增殖，材料應產生相應的降解，為細胞的生長讓出空間，且其降解產物應無毒副作用。

生物3D打印領域同樣也面臨著組織工程和再生醫(yī)學領域所共同面臨的其他挑戰(zhàn)。比如，3D打印構建組織器官的內部血管化問題。一些研究報道已經證明了構建生物打印器官內分支血管網(wǎng)的可行性(圖12)[34, 79, 135, 136]。目前，3D打印構建血管網(wǎng)絡的一個挑戰(zhàn)是該方法處理過程與材料、細胞以及印刷系統(tǒng)中其他組件的兼容性。另外，在整個組織構建體中血管網(wǎng)絡產生并成熟所需的時間可能長于細胞的存活時間。生物反應器可以幫助維持組織構建體的活性，并為后處理中組織融合、重塑和成熟爭取所需時間。另外，人體內血管網(wǎng)絡是一個從粗到細逐漸變化的非勻質網(wǎng)絡結構。未來的一個可能的解決策略是，在3D打印成型的過程中，利用自犧牲材料來構建大的聯(lián)通血管網(wǎng)絡；植入后，通過植入物周圍血管網(wǎng)絡的自發(fā)長入，來構建中或毛細血管網(wǎng)路；通過誘導植入物內干細胞的定向分化，在植入物內部產生毛細血管網(wǎng)。

圖11 多材料生物墨水快速打印類人體器官結構：(a)研究者所設計的七通道打印頭示意圖；(b，c)打印頭通道及噴嘴處實物照片；(d)生物3D打印成型的多組分心形結構及其在不同材質交界處的熒光照片；(e)單獨打印成型的類人體器官(包括腦、肺、心臟、肝臟、腎臟、胰腺、胃、小腸/大腸、膀胱和前列腺)構建體及其在人體相對位置處拼合照片[134]Fig.11 Rapid continuous multimaterial extrusion bioprinting: (a) Schematic of the developed printer with seven-channel printhead; (b,c) Photographs showing the setup of the Festo valves and printhead; (d) Fluorescence images of the printed multi-component heart-like structure and different junction regions; (e) Bioprinting of human organ-like constructs, including brain, lung, heart, liver, kidneys, pancreas, stomach, small/large intestines, bladder and prostate, the organ-like constructs were individually printed, photographed and stitched together in the same image at relative locations as those in the human body[134]

圖12 含血管網(wǎng)絡組織器官的3D打印構建：(a)含血管結構構建過程示意圖；(b，c)含血管結構的3D打印構建體的橫面及縱切面熒光照片；(d)在載成纖維細胞基質內由HUVECs細胞構建血管結構的示意圖及熒光照片；(e)綠色熒光蛋白標記的人新生真皮成纖維細胞HNDFs(GFP-HNDFs)細胞在血管周邊的分布(熒光強度)[136]Fig.12 Three-dimensional vascularized tissue fabrication: (a) Schematic illustration of the tissue manufacturing process; (b, c) Photograph of printed tissue construct housed within a perfusion chamber and the corresponding cross-sections; (d) Long-term perfusion of HUVEC-lined (red) vascular network supporting HNDF-laden (green) matrix shown by top-down (left) and cross-sectional confocal microscopy (right); (e) GFP-HNDF distribution within the 3D matrix shown by fluorescent intensity as a function of distance from vasculature[136]

因此，研發(fā)新型生物3D打印高分子材料并賦予其更加豐富的成型方式，優(yōu)化材料的力學性能，使其具有更好的打印性；通過仿生、負載生物活性因子等方法改善高分子材料的生物學特性；結合其它材料，開發(fā)異質、梯度化復合材料；設計調控材料的降解性能及促血管化能力，提高打印細胞及組織器官的存活及功能維持；建立生物3D打印材料標準及生產工藝規(guī)范等，將是未來的重要研究方向。我們相信隨著打印材料種類的拓寬和性能的完善，生物3D打印終將為健康醫(yī)療應用方面帶來變革性的改變。