侯月娥，伍建敏，王鳳求，趙玉林，張 杰，王貴平，李中圣

( 廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 511400 )

草魚(yú)呼腸孤病毒(Crasscarpreovirus，GCRV)是我國(guó)研究人員于1983年分離出的一株草魚(yú)出血病病毒，經(jīng)研究后按照其在形態(tài)學(xué)和理化特性等方面的特征最終鑒定[1]。草魚(yú)呼腸孤病毒是水生動(dòng)物呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)中毒力、傳染性、致病性均較強(qiáng)的病毒，暴發(fā)高峰期可引起高達(dá)90%的死亡率，病魚(yú)以體表充血、出血為主要癥狀，口腔、眼部、鰓、肝、脾、腎等器官和組織也可見(jiàn)不同程度的充血、出血現(xiàn)象，給我國(guó)的草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒病原學(xué)復(fù)雜、毒株變異大。曾偉偉等[2]根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的草魚(yú)呼腸孤病毒序列，將其分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。至今，已報(bào)道的分離株有30余株，通過(guò)對(duì)近5年提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的草魚(yú)呼腸孤病毒基因序列進(jìn)行分析和比較后發(fā)現(xiàn)，19個(gè)草魚(yú)呼腸孤病毒新分離株中的16株為Ⅱ型，占整個(gè)草魚(yú)呼腸孤病毒新分離株的84%，可見(jiàn)草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅱ型毒株為當(dāng)前流行株[3-11]。

草魚(yú)呼腸孤病毒診斷方法主要為免疫學(xué)診斷，如葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)法[12]、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法[13]、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法[14]；電鏡觀察也常用于草魚(yú)呼腸孤病毒病毒病的診斷[15]。草魚(yú)呼腸孤病毒免疫學(xué)診斷法在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)中使用頻率較高、特異性好，但操作復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員的專(zhuān)業(yè)性要求較高。實(shí)驗(yàn)室中針對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒核酸的RT-PCR檢測(cè)是普遍使用的檢測(cè)手段[16]，可有效區(qū)分不同基因型草魚(yú)呼腸孤病毒。本研究首先建立了草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅱ型熒光定量PCR檢測(cè)法，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)將檢測(cè)試劑整體凍干，制備了一種可常溫長(zhǎng)期保存、快速檢測(cè)的核酸檢測(cè)法，該方法適合草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅱ型的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，為草魚(yú)呼腸孤病毒預(yù)防和控制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株及質(zhì)粒

草魚(yú)呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒(Springviremiaofcarpvirus, SVCV)、傳染性造血器官壞死癥病毒(Infectioushematopoieticnecrosisvirus, IHNV)均由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司惠贈(zèng)。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和pMD18TM-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑和儀器

體液病毒RNA小量制備試劑盒(Axygen公司)；RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)；dNTP(TaKaRa公司)；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、普通質(zhì)粒小量提取試劑盒(Omega公司)；NeuM凍干保護(hù)劑由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院提供。CFX384Real-Time Systerm、S1000 Thermal Cycler(廣東昊洋貿(mào)易有限公司)；核酸蛋白檢測(cè)儀(Thermo)(廣東東銳儀器設(shè)備有限公司)；Triad冷凍干燥器(照生有限公司)。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)草魚(yú)呼腸孤病毒(GQ896337)的核酸序列，利用Beacon Designer 7設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針(表1)，引物和探針由上海Invitrogen公司合成。

表1 草魚(yú)呼腸孤病毒的熒光定量RT-PCR探針及擴(kuò)增引物

1.4 草魚(yú)呼腸孤病毒總核酸的提取及模板的制備

參照病毒RNA小量制備試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒傳代細(xì)胞中的總核酸。取草魚(yú)呼腸孤病毒的總RNA部分反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并置于超低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 草魚(yú)呼腸孤病毒基因片段克隆及標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別以草魚(yú)呼腸孤病毒的cDNA為模板，GCRV-F/GCRV-R (10 pmol/L)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。將切膠純化的PCR產(chǎn)物分別克隆至pMD-18T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-GCRV，將陽(yáng)性的重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定[17]。并采用thermo核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定重組質(zhì)粒密度，換算成個(gè)數(shù)。

1.6 TaqMan熒光定量RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化

調(diào)節(jié)草魚(yú)呼腸孤病毒的引物和探針終濃度為0.1～0.6 μmol/L，反轉(zhuǎn)錄時(shí)間5～15 min，退火溫度55～65 ℃，不同濃度配比、反轉(zhuǎn)錄時(shí)間和退火溫度單獨(dú)進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)優(yōu)化，選擇其中結(jié)果最好的引物、探針濃度、反轉(zhuǎn)錄時(shí)間及退火溫度。

1.7 反應(yīng)試劑凍干品的制備

1.7.1 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

將凍干保護(hù)劑稀釋為4組不同的濃度(10、8、5、1.25 μmol/mL)同配制好的反應(yīng)試劑混勻然后進(jìn)行無(wú)菌分裝，200 μL八連管每管加入100 μL反應(yīng)液(相當(dāng)于20 μL的反應(yīng)體系)。分裝后放于-80 ℃冰箱冷凍3 h，當(dāng)完全凍好以后，開(kāi)蓋放于已經(jīng)調(diào)試好的Triad冷凍干燥器里進(jìn)行冷凍干燥。冷凍程序?yàn)椋?35 ℃ 3 h，-20 ℃ 1 h，-15 ℃ 1 h，0 ℃ 3 h，25 ℃ 1 h。程序停止以后根據(jù)凍干樣品物理性狀選擇最佳的一組。

1.7.2 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑的使用方法

將凍干試劑用滅菌的去離子水16 μL進(jìn)行溶解，加入2 μL的陽(yáng)性對(duì)照品，同時(shí)用滅菌的去離子水作為陰性對(duì)照，每管20 μL，封蓋混勻離心。熒光定量RT-PCR的反應(yīng)條件均為：42 ℃ 5 min，95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性10 s，退火溫度為RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化的最適溫度，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

1.8 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

將制備的草魚(yú)呼腸孤病毒標(biāo)準(zhǔn)品作10倍系列稀釋?zhuān)貌煌♂屘荻鹊闹亟M質(zhì)粒作為模板，每個(gè)梯度的質(zhì)粒設(shè)立3個(gè)重復(fù)。用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增。熒光定量RT-PCR的反應(yīng)條件均為：42 ℃ 5 min，95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性10 s，退火溫度為RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化的最適溫度，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

1.9 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑特異性、敏感性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.9.1 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑特異性試驗(yàn)

將提取的草魚(yú)呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒核酸作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。

1.9.2 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑敏感性試驗(yàn)

將測(cè)定好質(zhì)粒密度的模板進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)貌蒴~(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑測(cè)定其敏感性。與本試驗(yàn)室已經(jīng)建立草魚(yú)呼腸孤病毒普通PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較其敏感性。

1.9.3 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑穩(wěn)定性試驗(yàn)

自已經(jīng)稀釋好的質(zhì)粒樣品中選取密度為1×106個(gè)/μL為模板，對(duì)抽取的6個(gè)批次的草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算其Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

1.10 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑保存期試驗(yàn)

將凍干檢測(cè)試劑分別放置于室溫25 ℃和37 ℃保存，定期進(jìn)行其敏感性檢測(cè)，考察不同保存條件下的敏感性。

1.11 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑在手持式熒光PCR儀上的試驗(yàn)

手持式熒光PCR儀為單通道PCR儀，將1.5制備的草魚(yú)呼腸孤病毒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋?zhuān)貌煌♂屘荻鹊闹亟M質(zhì)粒作為模板，根據(jù)其已有內(nèi)置程序進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)進(jìn)行定性檢測(cè)，42 min可以看到結(jié)果。

1.12 臨床樣本的檢測(cè)試驗(yàn)

選取經(jīng)過(guò)檢測(cè)驗(yàn)證的草魚(yú)呼腸孤病毒陽(yáng)性樣品20份、草魚(yú)呼腸孤病毒可疑的樣品13份，未經(jīng)驗(yàn)證的樣品27份累計(jì)60份，樣品均來(lái)自廣東地區(qū)，采用本次構(gòu)建的一步法凍干檢測(cè)試劑進(jìn)行臨床樣品驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以草魚(yú)呼腸孤病毒合成的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。將切膠純化的PCR產(chǎn)物分別與pMD-18T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-GCRV，將陽(yáng)性的重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，草魚(yú)呼腸孤病毒引物能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段(圖1)。

圖1 草魚(yú)呼腸孤病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果1：草魚(yú)呼腸孤病毒；M：DL2000 Marker.

2.2 熒光定量RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化

引物、探針終濃度的不同配比、不同的退火時(shí)間以及不同退火溫度試驗(yàn)結(jié)果顯示，引物、探針的不同終濃度和不同的退火溫度都會(huì)引起Ct值的不同，而反轉(zhuǎn)錄時(shí)間5 min和15 min對(duì)Ct值沒(méi)有影響，GCRV-F/GCRV-R引物的終濃度0.2 μmol/L、探針終濃度為0.3 μmol/L、反應(yīng)條件退火溫度為60 ℃時(shí)，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)信號(hào)值最強(qiáng)，Ct值最小(圖2～圖3)。

圖2 草魚(yú)呼腸孤病毒引物濃度優(yōu)化1：引物濃度0.2 μmol/L；2：引物濃度0.25 μmol/L；3：引物濃度0.3 μmol/L.

圖3 草魚(yú)呼腸孤病毒退火溫度優(yōu)化a:退火溫度60 ℃；b:退火溫度55 ℃.

2.3 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，保護(hù)劑濃度達(dá)到8 μmol/mL時(shí)的Ct值與不加保護(hù)劑的反應(yīng)相同(圖4)，且該組的凍干形態(tài)也較好，凍干樣品致密，來(lái)回?fù)u動(dòng)不散開(kāi)，加入DEPC水迅速溶解，故將保護(hù)劑濃度定為8 μmol/mL(圖5)。

圖4 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干保護(hù)劑的優(yōu)化a:不加保護(hù)劑；b:8 μmol/mL保護(hù)劑；c:10 μmol/mL保護(hù)劑；d:5 μmol/mL保護(hù)劑；e:1.25 μmol/mL保護(hù)劑.

圖5 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑的凍干后的物理性狀

2.4 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

草魚(yú)呼腸孤病毒的熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)粒密度梯度為1×101～1×106個(gè)/μL的6個(gè)線性梯度的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈等距性和平行性，具有較好的梯度性(圖6)。

圖6 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑特異性、敏感性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑特異性試驗(yàn)

將提取的草魚(yú)呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒核酸作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，僅有草魚(yú)呼腸孤病毒的熒光信號(hào)為陽(yáng)性，其他兩種病毒的檢測(cè)均為陰性，說(shuō)明構(gòu)建的草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑的特異性較強(qiáng)，與其他病毒的基因無(wú)交叉反應(yīng)(圖7)。

圖7 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑的特異性試驗(yàn)GCRV為草魚(yú)呼腸孤病毒，SVCV為鯉春病毒血癥病毒，IHNV為傳染性造血器官壞死癥病毒.

2.5.2 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑敏感性試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋?zhuān)Y(jié)果顯示，對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒的擴(kuò)增效率較好，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的最低檢測(cè)量為101個(gè)/μL(圖8)。與實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的草魚(yú)呼腸孤病毒普通PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，是普通PCR敏感性的100倍(圖9)。

圖8 草魚(yú)呼腸孤病毒 凍干檢測(cè)試劑敏感性試驗(yàn)a～f曲線分別為草魚(yú)呼腸孤病毒質(zhì)粒密度1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101 個(gè)/μL.

圖9 普通草魚(yú)呼腸孤病毒標(biāo)準(zhǔn)品敏感性試驗(yàn)1～6分別為草魚(yú)呼腸孤病毒質(zhì)粒密度1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101 個(gè)/μL；M:DL2000 Marker.

2.5.3 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒密度為1×106個(gè)/μL為模板，對(duì)抽取的6個(gè)批次的草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，6個(gè)批次間的變異系數(shù)為3.6%(表2)，驗(yàn)證了該凍干試劑具有良好的穩(wěn)定性。

表2 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑熒光定量RT-PCR穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑保存期試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，凍干試劑分別在25 ℃ 180 d、37 ℃ 15 d與對(duì)照試劑(0 d樣品)檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異，敏感性均可以達(dá)到10個(gè)(表3)，由此說(shuō)明，草魚(yú)呼腸孤病毒的凍干檢測(cè)試劑在這兩種存放條件下的敏感性并未降低，質(zhì)量穩(wěn)定。

表3 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑不同保存條件下的敏感性試驗(yàn)(Ct值)

2.7 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑PCR敏感性

草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑在手持式熒光PCR儀和熒光定量PCR儀上的敏感性比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑不同PCR試驗(yàn)敏感性比對(duì)(Ct值)

2.8 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)20份普通PCR鑒定的已知臨床病料和13份可疑臨床病料以及未知的27份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，20份陽(yáng)性病料，病毒密度為2.3×103～6.4×107個(gè)/μL(超過(guò)以及等于106個(gè)/μL的樣品，均稀釋100后再次檢測(cè))，符合率為100%；13份可疑病料檢測(cè)結(jié)果顯示，5份感染草魚(yú)呼腸孤病毒，病毒密度為1.0×102～3.1×103個(gè)/μL，陽(yáng)性率為38.46%。27份未驗(yàn)證病料的檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性感染的有7份，病毒密度為4.3×102～5.1×108個(gè)/μL，感染率為25.93%，而普通PCR僅檢測(cè)出3份，感染率為11.11%。

3 討 論

草魚(yú)呼腸孤病毒是危害草魚(yú)魚(yú)苗階段的一種病毒性魚(yú)病，目前我國(guó)針對(duì)預(yù)防草魚(yú)呼腸孤病毒的疫苗如組織滅活疫苗、細(xì)胞滅活疫苗、細(xì)胞弱毒疫苗以及基因工程亞單位疫苗均有小范圍使用，也取得了不錯(cuò)的效果，但是仍然無(wú)法對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒進(jìn)行有效控制，每年都會(huì)給養(yǎng)殖戶造成較大的損失。因此對(duì)該病的快速、準(zhǔn)確、定性、定量以及便捷的檢測(cè)就顯得尤為重要。

本研究建立的一步法凍干檢測(cè)試劑檢測(cè)方法，是利用探針設(shè)計(jì)和引物設(shè)計(jì)的兩種軟件相互驗(yàn)證[18]，并對(duì)體系中引物、探針、酶、反應(yīng)液鹽濃度等條件進(jìn)行了反復(fù)篩選調(diào)整和優(yōu)化，最終確定了一個(gè)最佳檢測(cè)反應(yīng)條件。在此優(yōu)化的基礎(chǔ)上將除核酸以外的所有成份(含保護(hù)劑)進(jìn)行優(yōu)化，添加在八連管中，分裝后放于-80 ℃冰箱冷凍3 h，當(dāng)完全凍好以后，開(kāi)蓋放于已經(jīng)調(diào)試好的Triad冷凍干燥器里進(jìn)行冷凍干燥，最終確定了對(duì)反應(yīng)無(wú)影響的保護(hù)劑組合和凍干條件。干燥好的凍干檢測(cè)試劑可以常溫運(yùn)輸和短時(shí)間保存，均不會(huì)影響其性能，省去了各種試劑的混合和條件摸索以及在冰盒上的操作，也降低了對(duì)工作人員的專(zhuān)業(yè)要求。直接用DEPC水進(jìn)行溶解添加所需檢測(cè)的RNA，置于熒光定量PCR儀，通過(guò)分析軟件能直觀詳細(xì)記錄整個(gè)RT-PCR過(guò)程，無(wú)需再置備熒光定量專(zhuān)用的離心管，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以及瓊脂糖凝膠電泳，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以直接從軟件上得到病毒的準(zhǔn)確密度。有效減少假陽(yáng)性和污染發(fā)生的機(jī)會(huì)，步驟簡(jiǎn)單快捷。

草魚(yú)呼腸孤病毒一步法凍干檢測(cè)試劑的特異性結(jié)果顯示，將提取的草魚(yú)呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒核酸RNA為模板進(jìn)行試驗(yàn)，僅有目的曲線擴(kuò)增，其余均為陰性，說(shuō)明其具有良好的特異性；敏感性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，其敏感性可達(dá)到101個(gè)/μL，r2>99.9%，具有較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系；6個(gè)批次間的變異系數(shù)為3.6%，穩(wěn)定性較好；與常規(guī)的RT-PCR反應(yīng)方法比較，是普通RT-PCR敏感性的100倍。周勇等[19]建立的草魚(yú)呼腸孤病毒熒光定量檢測(cè)方法特異性和敏感性均較好，但是操作繁瑣，試劑必須低溫保存，不方便運(yùn)輸，不能普及。而本研究的草魚(yú)呼腸孤病毒凍干檢測(cè)試劑可以在常溫操作而不影響其敏感性，也可以利用手持式熒光PCR儀，將樣品放置好，42 min就可以判定是否感染。彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法重復(fù)性和耗時(shí)長(zhǎng)的不足，同時(shí)具有較高的特異性，可以避免臨床樣品中其他病原的干擾。這對(duì)于草魚(yú)出血病的早期診斷、病毒定量檢測(cè)、致病機(jī)理研究以及防控技術(shù)研究等且有重要意義。