熊 鋼，周先文，王曉清，巫旗生，康 驪，秦 溱，曾志南

( 1.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410127； 2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000； 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 4.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361013 )

東風(fēng)螺屬(Babylonia)屬軟體動(dòng)物門(mén)、腹足綱、新腹足目、蛾螺科[1]，俗稱(chēng)花螺、南風(fēng)螺和泥螺等，是我國(guó)沿海重要的經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物。我國(guó)現(xiàn)有方斑東風(fēng)螺(B.areolata)、泥東風(fēng)螺(B.lutosa)和臺(tái)灣東風(fēng)螺(B.formosae)3種[2-3]。泥東風(fēng)螺肉質(zhì)鮮美，是暢銷(xiāo)的優(yōu)質(zhì)海產(chǎn)貝類(lèi)，在近十年開(kāi)發(fā)為海水養(yǎng)殖品種[4-5]。然而泥東風(fēng)螺野生資源銳減，為此泥東風(fēng)螺人工繁育[6-7]、人工增殖[8]和增殖效果評(píng)估[9]相關(guān)研究工作相繼開(kāi)展。

泥東風(fēng)螺作為后生動(dòng)物，其線粒體DNA為典型的環(huán)狀雙鏈分子結(jié)構(gòu), 長(zhǎng)度大多為14～18 kb，編碼37個(gè)基因，包括13個(gè)蛋白質(zhì)基因、22個(gè)tRNA以及12S RNA和16S RNA[10]。線粒體基因組是核外遺傳物質(zhì),具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳等特點(diǎn),成為生物多樣性、群體遺傳學(xué)與系統(tǒng)進(jìn)化研究中的重要分子標(biāo)記[11-12]。目前，線粒體基因已作為種類(lèi)鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析和群體遺傳多樣性的重要分子標(biāo)記，并且線粒體ND2、16S RNA、Cyt b基因、D-loop序列已被應(yīng)用于貝類(lèi)[13-14]、甲殼類(lèi)[15]、魚(yú)類(lèi)[16-17]等水產(chǎn)動(dòng)物物種遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析中。

為調(diào)查泥東風(fēng)螺野生群體資源遺傳多樣性，筆者采用PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序技術(shù)對(duì)采自北海、連江和長(zhǎng)樂(lè)的野生泥東風(fēng)螺群體樣本進(jìn)行群體遺傳多樣性和遺傳距離分析，從分子水平闡明我國(guó)沿海泥東風(fēng)螺的遺傳性狀，研究結(jié)果將為泥東風(fēng)螺資源恢復(fù)、保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

泥東風(fēng)螺為自福建連江(30個(gè)樣本)、福建長(zhǎng)樂(lè)(30個(gè)樣本)和廣西北海(30個(gè)樣本)捕撈的野生泥東風(fēng)螺群體。

1.2 總DNA的提取

取泥東風(fēng)螺腹足，采用天澤基因柱式動(dòng)物DNA提取試劑盒提取泥東風(fēng)螺總DNA?？侱NA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因擴(kuò)增和測(cè)序

以獲得的泥東風(fēng)螺轉(zhuǎn)錄組中線粒體基因信息設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物[18]，擴(kuò)增福建連江野生泥東風(fēng)螺樣本總DNA。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、切膠和回收純化后送鉑尚生物進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 泥東風(fēng)螺線粒體基因組擴(kuò)增引物

1.4 線粒體基因組環(huán)狀結(jié)構(gòu)和序列分析

將送檢測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行校對(duì)和人工去除錯(cuò)誤拼接(GenBank登陸號(hào)：KF897830)。利用OGDraw軟件[19]對(duì)泥東風(fēng)螺線?；蚪M進(jìn)行制圖，并在GenBank中進(jìn)行Blast分析；采用Mega 5.1[20]軟件構(gòu)建最大似然法和鄰接法物種線粒體基因組分子系統(tǒng)樹(shù)，1000次重復(fù)抽樣自展法評(píng)估各分支的置信度。用DnaSp 5.1[21]軟件分析3個(gè)野生群體基因的遺傳多樣性參數(shù)，使用Mega 5.1[20]軟件計(jì)算群體內(nèi)和群體間的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組環(huán)狀結(jié)構(gòu)

OGDraw構(gòu)建的泥東風(fēng)螺線粒體基因組結(jié)構(gòu)(圖1)表明，泥東風(fēng)螺線粒體基因組含有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA和2個(gè)rRNA；其中ATPase6、ND1、ND4L基因的終子密碼子為T(mén)AG，ND5基因則為不完全終子密碼子；其中ND2與COXⅠ，tRNA-Trp與tRNA-Gln，tRNA-Gly與tRNA-Glu，tRNA-Glu與12S RNA、tRNA-Glu，ND6與Cytb、ND4L與ND4基因存在重疊區(qū)；在環(huán)狀線粒體基因結(jié)構(gòu)中，tRNA-Met、tRNA-Tyr、tRNA-Cys、tRNA-Trp、tRNA-Gln、tRNA-Gly、tRNA-Glu和tRNA-Thr位于環(huán)形線粒體L鏈上。

2.2 基因相似性和保守性分析

在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行相似性分析得到17種腹足綱貝類(lèi)動(dòng)物線粒體基因組(表2)。使用DNAMAN軟件分析泥東風(fēng)螺與17種腹足綱動(dòng)物線粒體基因組全長(zhǎng)及線粒體上12S RNA、16S RNA、COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ、和Cytb基因相似性(表3)。研究結(jié)果表明，18種腹足綱動(dòng)物線粒體基因組間相似性為70.1%～92.9%；泥東風(fēng)螺與其他貝類(lèi)間的相似性為74.1%～92.9%，泥東風(fēng)螺與方斑東風(fēng)螺相似性最高，達(dá)92.9%；除與似鮑羅螺(Concholepasconcholepas)的COXⅢ基因相似性為50.4%外，泥東風(fēng)螺線粒體上的COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ、12S RNA、16S RNA、Cytb基因與其他17個(gè)物種對(duì)應(yīng)基因的相似性為70.07%～99.00%；將泥東風(fēng)螺與其他貝類(lèi)線粒體基因組全長(zhǎng)及各基因相似性作折線圖(圖2)可知，12S RNA和16S RNA相似性折線與線粒體基因組全長(zhǎng)相似性折線變化相似。經(jīng)12S RNA和16S RNA基因保守性分析發(fā)現(xiàn)，物種之間12S RNA的391～491 bp區(qū)域?yàn)楦叨茸儺悈^(qū)，物種之間16S RNA的1～106 bp和361～481 bp區(qū)域?yàn)楦叨茸儺悈^(qū)，而物種之間16S RNA的1191～1317 bp區(qū)域?yàn)楦叨缺Ｊ貐^(qū)；物種之間COXⅢ相似性與線粒體基因全長(zhǎng)相似性表現(xiàn)相當(dāng)，而COXⅠ、COXⅡ基因相似性更高，這兩個(gè)基因的物種間相似性均值分別為82.96%和83.00%。

圖1 泥東風(fēng)螺線粒體基因組環(huán)狀結(jié)構(gòu)

GenBank登錄號(hào)物種長(zhǎng)度/bpKF897830泥東風(fēng)螺15 346GU196685榧螺(Amalda northlandica)15 354DQ238598東泥織紋螺(Ilyanassa obsoleta)15 263EU827201織紋螺(Nassarius reticulatus)15 271DQ284754黑點(diǎn)卷管螺(Lophiotoma cerithiformis)15 380KM213962脈紅螺(Rapana venosa)15 272EU827194染料骨螺(Bolinus brandaris)15 380DQ159954蚵巖螺(Thais clavigera )15 285EU827200黑齒法螺(Cymatium parthenopeum)15 270JQ446041似鮑羅螺15 495EU827197錐螺(Fusiturris similis)15 595EU440735擬釘螺(Tricula hortensis)15 179KJ587748方斑東風(fēng)螺15 356KT962044水泡蛾螺(Buccinum pemphigus )15 265KT382829培利渦螺(Volutharpa perryi)15 255KU246047香螺(Neptunea arthritica)15 256KM603509縱肋織紋螺(Varicinassa variciferus )15 269KP716635蟾蜍鼓螺(Galeodea echinophora)15 388

表3 腹足綱貝類(lèi)線粒體基因組相似性 %

圖2 泥東風(fēng)螺與17種腹足綱貝類(lèi)線粒體基因相似性1.榧螺；2.東泥織紋螺；3.織紋螺；4.黑點(diǎn)卷管螺；5.脈紅螺；6.染料骨螺；7.蚵巖螺；8.黑齒法螺；9.似鮑羅螺；10.錐螺；11.擬釘螺；12.方斑東風(fēng)螺；13.水泡蛾螺；14.培利渦螺；15.香螺；16.縱肋織紋螺；17.蟾蜍鼓螺.

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

由Mega 5.1[20]軟件最大似然法和鄰接法構(gòu)建的線粒體基因組系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖4)可知，蛾螺科中泥東風(fēng)螺和方斑東風(fēng)螺聚成一支，織紋螺科的織紋螺和縱肋織紋螺于蛾螺科內(nèi)后聚成一支；圓口螺科的擬釘螺獨(dú)立成支；榧螺和東泥織紋螺聚成一支，似鮑羅螺與骨螺科相似性較高；由這18種軟體動(dòng)物線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)看，線粒體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與形態(tài)學(xué)分類(lèi)有異。

2.4 序列變異特征分析

3個(gè)野生泥東風(fēng)螺群體每個(gè)群體取3個(gè)個(gè)體擴(kuò)增線粒體基因組全長(zhǎng)序列，比對(duì)試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在COXⅠ與COXⅡ基因相連區(qū)域有較多的變異位點(diǎn)。進(jìn)一步對(duì)3個(gè)群體內(nèi)各30個(gè)野生泥東風(fēng)螺DNA樣本以引物F5擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)果表明，變異位點(diǎn)分布在4067～4784 bp區(qū)域，共40個(gè)變異位點(diǎn)(圖5)，變異均為轉(zhuǎn)換或顛換，沒(méi)有檢測(cè)到插入和缺失現(xiàn)象。

圖3 腹足綱貝類(lèi)12S RNA和16S RNA基因保守區(qū)和變異區(qū)

2.5 群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

泥東方螺各野生群體的單倍型分布(表4)和群體遺傳距離(表5)分析表明，連江野生群體和北海野生群體中均檢測(cè)到10個(gè)單倍型，而北海野生群體中檢測(cè)到16個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，3個(gè)野生群體的單倍型多樣性為(0.406±0.112)～(0.532±0.113)，3個(gè)野生群體的核苷酸多樣性為(0.00094±0.00124)～(0.00111±0.00123)；北海野生群體與連江野生群體和長(zhǎng)樂(lè)野生群體之間的遺距離分別僅為0.00094和0.00099。

圖5 F5引物擴(kuò)泥東風(fēng)螺線粒體基因組片段序列變異位點(diǎn)

種類(lèi)年齡體質(zhì)量/g體長(zhǎng)/cm全長(zhǎng)/cm鰱魚(yú)2齡706.2±110.335.1±1.9542.7±2.12(n=9)510～86530.6～37.537.6～45.03齡1148.1±244.240.5±4.0549.0±4.64(n=8)925～168534.6～48.042.2～56.84齡2058.3±166.649.3±2.4759.5±3.10(n=6)1880～221047.2～52.056.8～62.9鳙魚(yú)2齡858±70.235.64±0.9343.6±1.03(n=7)780～98534.2～36.941.8～45.23齡1641.7±143.444.82±0.8653.5±0.61(n=6)1415～181543.3～45.752.6～54.04齡3391.7±385.857.0±2.3868.6±2.92(n=5)2890～402553～59.464.3～72.05齡7495.7±510.374.1±4.4892.3±3.51(n=5)6921～789669.9～78.889～96

表5 泥東風(fēng)螺群體遺傳距離

3 討 論

3.1 線粒體基因組遺傳進(jìn)化

對(duì)18種腹足綱動(dòng)物線粒體基因組保守性分析發(fā)現(xiàn)，12S RNA的391～491 bp區(qū)域和16S RNA的1～106 bp和361～481bp區(qū)域?yàn)楦叨茸儺悈^(qū)，16S RNA的1191～1317 bp區(qū)域?yàn)楦叨缺Ｊ貐^(qū)。泥東風(fēng)螺作為后生動(dòng)物，線粒體基因組中常含有多個(gè)長(zhǎng)度不等的非編碼區(qū)[22]，通常認(rèn)為在最大的非編碼區(qū)中包含有線粒體基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄信號(hào),這些非編碼區(qū)被稱(chēng)為控制區(qū)[10]，在其他水產(chǎn)動(dòng)物中非編碼控制區(qū)存在D-loop結(jié)構(gòu)[17]，但在本研究的泥東風(fēng)螺線粒體基因組非編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)D-loop結(jié)構(gòu)。另外，泥東風(fēng)螺線粒體基因組中也未發(fā)現(xiàn)在后生動(dòng)物線粒體控制區(qū)中常見(jiàn)的較高AT含量的簡(jiǎn)單串連重復(fù)序列[23]，這種結(jié)構(gòu)在線粒體基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的早期階段發(fā)揮著重要作用[23-24]。

3.2 泥東風(fēng)螺野生群體遺傳分化

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)和物種進(jìn)化潛能的保證，基因核苷酸多樣性是衡量線粒體基因遺傳多樣性的重要指標(biāo)。本研究采用16S RNA[25]和COXⅠ[26]基因通用引物對(duì)3個(gè)泥東風(fēng)螺野生群體擴(kuò)增片段測(cè)序，結(jié)果比對(duì)并未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。但在比對(duì)3個(gè)群體中擴(kuò)增的部分泥東風(fēng)螺線粒體基因組全長(zhǎng)序列后發(fā)現(xiàn)，COXⅠ和COXⅡ基因相鄰區(qū)域附近存在較多變異位點(diǎn)，進(jìn)一步用F5引物擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)，野生泥東風(fēng)螺線粒體基因組變異位點(diǎn)主要分布在4067～4784 bp區(qū)域，3個(gè)野生群體在此片段共檢測(cè)到40個(gè)變異位點(diǎn)，26個(gè)單倍型，整體遺傳多樣性較低；泥東風(fēng)螺種內(nèi)變異區(qū)間自COXⅠ基因的3′編碼區(qū)段至COXⅡ基因的5′編碼區(qū)，40個(gè)變異位點(diǎn)在COXⅠ基因3′編碼區(qū)、COXⅡ基因5′編碼區(qū)和COXⅠ與COXⅡ基因相鄰的非編碼區(qū)無(wú)明顯的分布特征。通常物種間基因的非編碼區(qū)為變異區(qū)，但在線粒體上各相鄰基因的非編碼區(qū)段非常短，有的相鄰基因甚至共用編碼區(qū)。如泥東風(fēng)螺線粒體上基因存在12個(gè)基因共用編碼片段，12個(gè)相鄰基因間無(wú)非編碼的堿基相隔，且相鄰基因間的非編碼區(qū)長(zhǎng)度也為0～58 bp，可能是這種現(xiàn)象使得種內(nèi)基因變異位點(diǎn)在非編碼區(qū)分布不集中?？紤]泥東風(fēng)螺野生資源減少，因此推測(cè)野生群體遺傳進(jìn)化潛力水平受到了人工捕撈的影響，核苷酸變異和分化程度較低。連江和長(zhǎng)樂(lè)野生群體之間的遺傳距離相對(duì)北海群體較高的原因除地理因素之外還有人工捕撈因素，因此促進(jìn)了兩群體之間的基因交流。

由于所涉及野生樣品數(shù)量限制，本研究只使用線粒體基因突變位點(diǎn)較多的片段序列進(jìn)行分析，因此，下一步還需結(jié)合微衛(wèi)星[27]和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性[28]指紋相關(guān)的分子標(biāo)記技術(shù)，更全面地評(píng)估野生泥東風(fēng)螺資源狀況和泥東風(fēng)螺人工增殖效果。本研究為利用線粒體進(jìn)行泥東風(fēng)螺群體的分子遺傳學(xué)、遺傳結(jié)構(gòu)和種質(zhì)鑒定提供參考依據(jù)。