王 越 成 鈺 李秋芬 張 艷

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

城鎮(zhèn)生活污水、工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)肥料污染等帶來的環(huán)境中過多的N會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生危害(姜愛霞,2000)。生物脫氮技術(shù)因可以彌補(bǔ)物理化學(xué)法的缺點(diǎn)，成本低、效率高、操作簡單且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染(梁劉艷等, 2001)而受到重視。傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)具有硝化菌與反硝化菌對(duì)環(huán)境的要求不同、硝化菌生長緩慢且反硝化過程消耗有機(jī)氮源導(dǎo)致反應(yīng)速率減緩等缺點(diǎn)(程海華等, 2016)。隨著生物脫氮理論與技術(shù)的發(fā)展，越來越多的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌(Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,HN-AD)被發(fā)現(xiàn)和研究，這類菌株在生物脫氮過程中具有同時(shí)去除C和N、硝化與反硝化同時(shí)進(jìn)行、無二次污染、節(jié)約反應(yīng)系統(tǒng)面積與成本等獨(dú)特優(yōu)勢(Renet al, 2014； 孫雪梅等, 2012； 喬森等, 2014； 蘇婉昀等, 2013)。因而，HN-AD的研究逐步成為生物脫氮研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。目前，我國對(duì)這類菌株的研究尚處于起步階段，主要集中于菌株篩選和脫氮特性研究(劉晶晶等, 2008； Wanget al, 2009； 黃鈞等, 2009；Yaoet al, 2013)，對(duì)其脫氮條件和機(jī)理的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)室從刺參(Apostichopus japonicus)養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到1株HN-AD菌，經(jīng)鑒定為花津?yàn)┭挎邨U菌(Bacillus hwajinpoensis)，命名為 SLWX2(成鈺等,2016)。Chen 等(2011)、Ka?ar 等(2013)和 Phelan 等(2013)也分別在海膽(Echinoidea)、愛琴海東部海岸和海綿(Phylum porifera)中檢測到花津?yàn)┭挎邨U菌，但并未見對(duì)其脫氮性能的研究報(bào)道。環(huán)境因素對(duì)微生物脫氮性能的發(fā)揮具有重要意義，目前，已有許多研究表明，不同氮源、pH、溶解氧、溫度對(duì)不同脫氮生物的脫氮效率有明顯影響(劉國玉等, 2003； 劉芳,2014)。本實(shí)驗(yàn)室已研究了SLWX2在多種氮源同時(shí)存在情況下的脫氮特性及其對(duì)不同濃度無機(jī)氮的耐受范圍(成鈺等, 2016)。本研究報(bào)道不同氮源和不同環(huán)境因子對(duì)該菌株生長及脫氮效果的影響，探究其最佳脫氮條件，以期為菌株 SLWX2在生物脫氮工程中的使用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本實(shí)驗(yàn)室由刺參養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到 1株花津?yàn)┭挎邨U菌，命名為SLWX2。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中的葡萄糖過濾滅菌后，按比例加入到已滅菌的其他成分中。上述藥品均為分析純，采購自國藥集團(tuán)。

1.3 不同氮源對(duì)菌株脫氮特性的影響

將活化后處于對(duì)數(shù)生長期的 SLWX2菌液，接入分別以(NH4)2SO4、NaNO2和 KNO3為唯一氮源的培養(yǎng)基，使菌液終濃度在(1.8～1.9)×106CFU/ml范圍內(nèi)，每種3個(gè)平行，于28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)42 h。每6 h取樣檢測OD600值及-N、-N、-N和總氮(TN)的濃度。

1.4 不同環(huán)境因素對(duì)菌株生長和脫氮的影響

將對(duì)數(shù)生長期的SLWX2菌液接種在-N培養(yǎng)基內(nèi)，保證菌液終濃度在(1.8～1.9)×106CFU/ml范圍內(nèi)，每組3個(gè)平行。培養(yǎng)基根據(jù)硝化培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整，-N初始濃度約為50 mg/L，在實(shí)驗(yàn)條件中，溫度為28℃、鹽度為30、pH為7、C/N為10的基礎(chǔ)上，控制單因素變量，各實(shí)驗(yàn)組單因素設(shè)定如下：

(1) 溫度：20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、50℃；

(2) pH：5、6、7、8、8.5、9；

(3) C/N：1、5、10、15、20、30、40；

(4) 鹽度：0、5、10、20、25、30、50、80

150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后，取樣測OD600值，離心，取上清液，測-N值。

1.5 無機(jī)氮和總氮的測定方法

參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.4-2007)，-N的測定采用次溴酸鹽氧化法；-N的測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法；-N的測定采用鋅-鎘還原法。TN測定采用總有機(jī)碳(Total organic carbon, TOC)分析儀(TOC-VCPH, TNM-1)，按照儀器使用說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 不同氮源對(duì)菌株脫氮特性的影響

2.1.1 硫酸銨為唯一氮源時(shí)菌株的脫氮特性 在(NH4)2SO4為唯一氮源的-N培養(yǎng)基(添加葡萄糖)中連續(xù)培養(yǎng)菌株SLWX242 h。開始培養(yǎng)的24 h中，菌體生長迅速，OD600值達(dá)到 0.45，無明顯延遲期，-N和TN質(zhì)量濃度由初始的54.28、54.63 mg/L分別降低至36.00、38.52 mg/L；培養(yǎng)30 h后，菌體OD600值增長為0.83，-N和TN質(zhì)量濃度迅速下降，去除率分別為82.50%和78.30%；之后菌體增殖稍緩慢，培養(yǎng)36 h后，-N和TN基本被去除完全，去除率分別達(dá) 96.4%和 93.7% (圖 1)。綜上可知，-N和TN的去除主要發(fā)生在SLWX2菌株的對(duì)數(shù)增長期(0～30 h)，表明以-N為唯一氮源時(shí)，菌株SLWX2可快速生長和脫氮，幾乎沒有延遲期，30 h內(nèi)，可去除80%以上的-N，在菌株SLWX2的生長過程中，未檢測到-N和-N。

圖1 氨氮培養(yǎng)基中各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of each index in the ammonia culture medium

2.1.2 亞硝酸鈉為唯一氮源時(shí)菌株的脫氮特性

在NaNO2為唯一氮源的培養(yǎng)基(添加葡萄糖)中，連續(xù)培養(yǎng)SLWX2菌株42 h。開始培養(yǎng)的30 h內(nèi)，菌體生長緩慢，-N和TN質(zhì)量濃度下降幅度不明顯，即菌株SLWX2對(duì)-N的適應(yīng)期較長；培養(yǎng)至30 h時(shí)，SLWX2菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，-N和TN質(zhì)量濃度開始有明顯的下降；培養(yǎng) 42 h后，OD600值達(dá)1.38，-N和TN去除率分別為99.9%和92.5%(圖2)。綜上可知，-N和TN的快速去除發(fā)生在30～42 h的對(duì)數(shù)生長期，即在 NaNO2為唯一氮源時(shí)，菌株SLWX2的生長和脫氮會(huì)延遲，去除-N主要在24 h以后，但對(duì)NaNO2的去除很徹底。

圖2 亞硝酸鹽氮培養(yǎng)基中各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of each index in the nitrite nitrogen medium

在SLWX2菌株的生長過程中，-N和-N的質(zhì)量濃度基于初始值小幅度波動(dòng)，沒有明顯積累，表明-N去除過程中，不產(chǎn)生-N和-H。

2.1.3 硝酸鉀為唯一氮源時(shí)菌株的脫氮特性 在KNO3為唯一氮源的培養(yǎng)基(添加葡萄糖)中，連續(xù)培養(yǎng)SLWX2菌株48 h，開始培養(yǎng)的30 h內(nèi)，菌體生長緩慢，-N和 TN質(zhì)量濃度基本無變化，即菌株SLWX2對(duì) KNO3具有較長適應(yīng)期；培養(yǎng)至 30 h時(shí)，SLWX2菌株進(jìn)入增殖迅速的對(duì)數(shù)生長期，-N和TN質(zhì)量濃度呈直線下降，出現(xiàn)-N的積累；培養(yǎng)42 h時(shí)，OD600值達(dá)0.98，-N和TN去除率分別為65.0%和46.6%，-N為14.69 mg/L，為最大累積量；隨后的6 h中，-N和TN持續(xù)下降，-N開始降低，到48 h時(shí)，-N和TN去除率分別達(dá)78.1%和75.7%，-N質(zhì)量濃度也降至0.051 mg/L(圖3)。綜上可知，-N和 TN的大量去除發(fā)生在菌株SLWX2的對(duì)數(shù)生長后期，即培養(yǎng)30 h之后。說明菌株SLWX2以-N為唯一氮源是，脫氮會(huì)發(fā)生延遲，主要發(fā)生在對(duì)數(shù)增長期的中后期，且脫氮效率較-N和-N稍低。

在菌株SLWX2整個(gè)脫氮過程中，檢測到NaNO2質(zhì)量濃度呈先上升后下降趨勢，有少量前期積累，但檢測不到-N，說明-N去除過程中產(chǎn)生-N，但不產(chǎn)生-N。

圖3 硝酸鹽氮培養(yǎng)基中各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of each index in the nitrate nitrogen medium

2.2 不同環(huán)境因素對(duì)菌株生長和脫氮的影響

2.2.1 溫度對(duì)菌株SLWX2生長和氨氮去除的影響

溫度對(duì)菌株 SLWX2的生長和脫氮能力影響較大。在 20℃條件下，菌體生長緩慢，濃度保持在很低的水平，且對(duì)-N的去除效果不明顯；在25℃、28℃條件下，菌株SLWX2菌體濃度和-N去除率較20℃時(shí)有所增加。在30～40℃的培養(yǎng)范圍內(nèi)，菌體均生長良好，且能高效脫氮，對(duì)應(yīng) OD600值分別為 1.200、0.931和0.764，-N去除率分別達(dá)99.8%、99.4%和84.7%。但在50℃培養(yǎng)條件下，菌體停止生長，OD600值僅為0.0191(圖4)。綜上可見，菌株SLWX2生長的適宜溫度為 28～40℃，并能實(shí)現(xiàn)較高的-N去除率，其中，最適菌體生長及脫氮溫度為30℃。

圖4 不同溫度對(duì)菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.2 pH對(duì)菌株SLWX2生長和氨氮去除的影響

菌株SLWX2在不同的pH條件下，培養(yǎng)24 h后測得的生長和-N去除情況見圖5。從圖5可以看出，菌株SLWX2能在pH為6～8.5范圍內(nèi)，較好生長且維持較高的-N去除率，相應(yīng)OD600值為0.249、0.261、0.464和0.364，去除率分別為49.9%、49.8%、59.6%和 55.8%。太偏酸性(pH為5)或堿性(pH為 9)的條件均不利于菌體生長和-N的去除，菌體OD600值僅為 0.0124和 0.131，-N去除率低至25.3%和23.2%(圖5)。綜上可見，弱酸、中性和弱堿(pH 為 6～8.5)條件下，菌株 SLWX2均能生長，其對(duì)pH具有較寬的適應(yīng)范圍，中性偏堿的條件更利于其生長及脫氮，最適pH為8.0。

圖5 不同pH對(duì)菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.5 Effect of pH on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.3 C/N對(duì)菌株SLWX2生長和氨氮去除的影響

菌株SLWX2在C/N為1時(shí)，OD600值僅為0.129，生長緩慢，且-N去除率僅為8.7%。隨著C/N的增大至25時(shí)，菌體生長速度與-N去除率逐漸提高。C/N為5～25時(shí)，菌體生長OD600值分別為0.235、0.248、0.264、0.291和0.463，對(duì)應(yīng)的-N去除率分別達(dá)16.0%、18.2%、23.1%、36.9%和45.7%。C/N為20～25時(shí)，菌體生長與-N去除效果最佳，但在C/N繼續(xù)增大時(shí)，菌體生長受到限制，OD600值明顯下降，對(duì)應(yīng)的-N去除率也降至10.0%和4.3%(圖6)。綜上可見，菌株SLWX2生長及脫氮的最適C/N為25。

圖6 不同C/N對(duì)菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.6 Effect of C/N on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.4 鹽度對(duì)菌株SLWX2生長和氨氮去除率的影響

從圖 7可以看出，菌株 SLWX2在 NaCl為 0～25 g/L培養(yǎng)條件下，具有良好的生長和脫氮性能，OD600值分別為 0.830、0.926、0.979、1.01和1.08，-N去除率均在90%以上，分別達(dá)99.4%、99.8%、96.2%、97.0%和 100%。菌體生長隨著 NaCl濃度的增加而受到限制，在NaCl為30 g/L時(shí)，-N去除率降至24.0%(圖7)。綜上可見，鹽度對(duì)菌株SLWX2的生長和-N去除有較大影響，淡水至低鹽度有利于菌體的生長和脫氮，生長及脫氮的最適鹽度為25，鹽度高于30則不利。

圖7 不同鹽度對(duì)菌株SLWX2生長和脫氮的影響Fig.7 Effect of salinity on the growth and nitrogen removal of SLWX2

3 討論

3.1 不同氮源對(duì)菌株脫氮性能的影響

生物脫氮可以發(fā)生在菌體生長的任何一個(gè)時(shí)期，因菌種而異。張光亞等(2003)研究表明，硝化作用主要發(fā)生在老齡細(xì)胞；辛玉峰等(2011)和黃廷林等(2015)分離得到的菌株不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.) YF14和皮特不動(dòng)桿菌(Acinetobacter pittii) A14，其硝化和反硝化均發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期；郭強(qiáng)等(2015)研究表明，地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)的硝化過程發(fā)生在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株SLWX2脫氮主要發(fā)生在菌體對(duì)數(shù)生長期，與王弘宇等(2009)、劉天琪等(2015)的結(jié)論一致。不同氮源條件下，菌株SLWX2進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期的時(shí)間不同，-N為氮源時(shí)，幾乎沒有延遲期，0～30 h為對(duì)數(shù)增長期，而-N和-N分別為氮源時(shí)，延遲期較長(0～30 h)，30～48 h才為對(duì)數(shù)增長期，與已報(bào)道的好氧反硝化比異養(yǎng)硝化更快進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期(蔣靜艷等, 2009)這一結(jié)論不同，可能是因?yàn)?個(gè)相關(guān)酶系的激活順序不同，或者NaNO2在溶液產(chǎn)生游離亞硝酸(FNA)，對(duì)菌株生長和代謝產(chǎn)生抑制作用(Zenget al, 2008)，又或者是菌株對(duì)-N和-N的耐受性較差。

3.2 環(huán)境因子對(duì)菌株生長和脫氮性能的影響

芽孢桿菌在微生物處理含 N廢水中有巨大的研究和應(yīng)用價(jià)值，而1株有應(yīng)用價(jià)值的脫氮菌株，也需要有較為寬泛的環(huán)境適應(yīng)性(李秋芬等, 2013)。本研究探究不同環(huán)境因素(溫度、pH、C/N、鹽度)對(duì)菌株SLWX2的生長和脫氮能力的影響，發(fā)現(xiàn)不同的溫度、pH、C/N和鹽度對(duì)該菌株的生長和脫氮均有明顯的影響，但該菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)范圍較寬，在溫度為28～40℃、pH為6～8.5、C/N 為 5～25、鹽度為 5～30的范圍內(nèi)，均能較好地生長，并維持較高的脫氮能力，而且菌體生長越好，脫氮效果越好，說明菌體生長和脫氮基本是同步進(jìn)行的，這與王娟等(2010)的研究結(jié)果一致。

多數(shù)報(bào)道的芽孢桿菌生長和脫氮性能研究均在30℃條件下進(jìn)行，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WZX-8的最大-N去除率發(fā)生在 30℃培養(yǎng)下(廖小紅等, 2009)，氣單胞菌(Aeromonassp.) HN-02的最佳-N去除溫度也為30℃(陳茂霞等, 2013)，這與本研究的菌株 SLWX2的最適生長和脫氮溫度相同。研究還發(fā)現(xiàn)，菌株SLWX2在40℃條件下,仍能良好生長和脫氮，-N去除率達(dá)84.7%，與其他這類菌株(梁賢等, 2015； 陳茂霞等, 2013； 李秋芬等, 2013)相比，具有耐高溫的優(yōu)勢。溫度為 20℃以下和 50℃以上時(shí)，菌體基本不生長，脫氮效果不佳，這是因?yàn)榈蜏厥沟妹富钚允艿揭种疲邷貤l件下，酶易失活，從而影響脫氮效果。

環(huán)境中pH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān)，是影響微生物活性的重要指標(biāo)之一。蘇俊峰等(2012)研究表明，環(huán)境中H+濃度不能超過微生物酶的適應(yīng)范圍，否則影響酶活性，影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。菌株SLWX2的最適脫氮pH范圍為6～8.5，與陳茂霞等(2013)研究的pH為6～9相似。而海水養(yǎng)殖水體的pH一般是中性或偏堿性，所以該菌株可以在實(shí)際養(yǎng)殖廢水處理中應(yīng)用。

異養(yǎng)菌通常需要有機(jī)物作為氮源和能源，有機(jī)碳不足時(shí)，不利于菌體生長，相應(yīng)的生理功能也會(huì)降低，因此，HN-AD菌對(duì)C/N的要求較高(鮮思淑等, 2016)。本研究通過固定 N添加量和調(diào)整葡萄糖的質(zhì)量濃度控制C/N時(shí)發(fā)現(xiàn)，在C/N為5～25范圍內(nèi)，-N去除率隨C/N增加而增大，但C/N高于30時(shí)，-N去除率開始下降，這種先上升后下降的趨勢與孫慶花等(2016)、李秋芬等(2013)研究結(jié)果相似。因?yàn)榈催h(yuǎn)高于菌體的生長所需量時(shí)，氮源成為非限制因素(王弘宇等, 2007)，過多的氮源會(huì)嵌入酶結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶活性降低，硝化能力也隨之下降(宋宇杰等, 2013)。不同菌株的最佳脫氮C/N并不相同，菌株X3的最佳C/N為5時(shí)(李秋芬等, 2013)，雷氏普威登斯菌(Providencia rettgeri) YL(席星林等, 2014)的最佳脫氮效果發(fā)生在C/N為 10時(shí)，假單胞菌 XS76(吳建江等, 2013)去除-N的最適C/N為15，本研究的菌株SLWX2對(duì)氮源的要求較高，最佳C/N為25，但實(shí)際含N廢水中的C/N較低，若增加氮源便導(dǎo)致脫氮成本增加，因此，還需要針對(duì)低C/N，對(duì)該菌進(jìn)行馴化，以提高脫氮效率。

微生物可以通過滲透壓調(diào)節(jié)自身新陳代謝，因而對(duì)鹽度有一定的適應(yīng)能力(張彥灼等, 2015)，但鹽度過高，會(huì)引起滲透壓升高而抑制代謝活動(dòng)，降低微生物活性，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞脫水發(fā)生質(zhì)壁分離，甚至死亡(鮮思淑等, 2016)。多數(shù)芽孢桿菌的脫氮特性研究都是在低鹽條件下進(jìn)行的，而本研究的菌株SLWX2是從海水中分離得到，具有較好的耐鹽性，NaCl為2.5%時(shí)，菌株生長和脫氮效果最佳，-N去除率達(dá)100%，NaCl為3%時(shí)，菌體仍能生長，也有一定的脫氮效果。值得關(guān)注的是該菌株在NaCl為0條件下仍生長良好，-N去除率達(dá)90%以上，這與同樣分離于海水的菌株X31 (馬放等, 2005)在無鹽條件下不能生長的特性相比，有明顯優(yōu)勢。綜上所述，該菌株在淡水或低鹽度含 N廢水處理中有較大的應(yīng)用價(jià)值，也可以通過馴化提高其耐鹽性，應(yīng)用于海水養(yǎng)殖廢水的脫氮。

以上研究表明，該菌株對(duì)無機(jī)氮和TN的脫除效率均較高，且對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)性也較寬，因此，具有較大的應(yīng)用潛力，后續(xù)將加強(qiáng)該菌在海水養(yǎng)殖污水處理中的實(shí)際驗(yàn)證。