馮 爍，張亞飛，栗云鵬，楊佐君，孫英健

（北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206）

牛角地黃湯源于唐代《千金備急藥方》，是由犀角、地黃、丹皮、赤芍四種主要成分組成[1]，目前原方中的犀角由牛角替代。牛角地黃湯在臨床上被公認為是治療溫病血分證候的代表方劑，具有涼血散瘀、清熱解毒的功效[2]，現(xiàn)代中醫(yī)常將本方用于治療急性重癥肝炎、肝昏迷、尿毒癥、過敏性紫癜、敗血癥等血分熱盛型疾病。金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌，Staphylococcus aureus），有“嗜肉菌”的別稱，致病力強，能產(chǎn)生的多種毒素和酶類，如溶血素（hemolysin）[3]、腸毒素（enterotoxin）[4]、毒性休克綜合征毒素-1（TSST-1）[5]、凝固酶（coagulase）[6]等是細菌產(chǎn)生的重要的毒力因子。動物感染金葡菌可引起機體局部化膿性感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎，甚至敗血癥、膿毒血癥等嚴重的全身感染[7]。特別是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）幾乎遍及全球，感染率和死亡率都較高[8]，多藥物耐藥的MRSA出現(xiàn)，增加了控制細菌感染的難度[9-10]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)部分中藥具有降低細菌耐藥性的作用[11-13]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，牛角地黃湯具有抑制金葡菌毒力因子溶血素活性及溶血素、腸毒素等毒力因子分泌的作用[14]。但牛角地黃湯對金葡菌耐藥性的影響尚未見報道。因此，本研究旨在研究牛角地黃湯對金葡菌對金葡菌苯唑西林鈉耐藥性及相關(guān)基因表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

金葡菌ATCC-29213和ATCC-43330購自鼎國生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

水牛角、生地黃、赤芍、丹皮購自北京同仁堂藥店；MHB培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；苯唑西林鈉購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金葡菌對苯唑西林鈉的耐受性檢測

以不含藥物的細菌培養(yǎng)組為陰性對照組，給予兩種金黃色葡萄球菌ATCC-29213、ATCC-43300培養(yǎng)基中添加不同濃度的苯唑西林鈉（2～512 μg/mL），于37℃溫箱中培養(yǎng)6 h，觀察細菌的生長情況。以培養(yǎng)基不發(fā)生渾濁，或OD值為陰性對照組OD值10%以下表示細菌增殖被抑制。

1.2.2 牛角地黃湯對金葡菌的苯唑西林鈉耐受性的影響

以只加苯唑西林鈉溶液的細菌培養(yǎng)組為陽性對照組，以不含藥的細菌培養(yǎng)組為陰性對照組，以含牛角地黃湯的MHB培養(yǎng)基為藥物對照組、試驗組給予牛角地黃湯（2.5、5、10 mg/mL）和不同濃度的苯唑西林鈉（2～512 μg/mL）溶液（見表 1），接種金黃色葡萄球菌ATCC-29213，37℃溫箱中培養(yǎng)6 h，觀察細菌的生長情況。

表1 試驗組處理方案Table 1 Treatment scheme of test group

1.2.3 牛角地黃湯對金葡菌基因轉(zhuǎn)錄組學分析

過夜培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，測OD值，并稀釋到OD600=0.5時，分裝菌液于4個試管中，加入不同濃度的牛角地黃湯（0、2.5、5、10 mg/mL），繼續(xù)在 37℃，150 rpm搖床中培養(yǎng)，5 h后收集菌體，液氮保存，送到華大基因進行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組學檢測。

常規(guī)方法提取樣品總RNA后，用試劑盒去除rRNA后進入下一步。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成第一條cDNA鏈，然后去除 dNTPs后，加入緩沖液、dATP，dGTP，dCTP，dUTP、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復、加polyA并連接測序接頭，然后用UNG酶消化第二條cDNA鏈，連接產(chǎn)物經(jīng)MiniElute PCR Purification Kit純化后，進行PCR擴增，建好的測序文庫用Illumina HiSeq2000進行測序。獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)處理去除含adaptor的reads，去除N的比例大于10%的reads，去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整個read的40%以上）.獲得Clean reads，選擇foldchange＞2的基因為差異表達基因，以S.aureus NCTC8325的基因組為參考基因組，將這些差異表達的基因同參考基因組進行比對，利用cluster軟件，對差異表達基因和實驗條件同時進行等級聚類分析。

1.2.4 金黃色葡萄球菌抗性相關(guān)基因表達分析

過夜培養(yǎng)金黃色葡萄球菌至OD600=0.5，分裝于5個試管中，加入不同濃度的牛角地黃湯劑（0、2.5、5、10 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)5 h，分別取經(jīng)離心的各組菌懸液，用PBS清洗3遍，分別向菌體沉淀中加入80 μL的TE緩沖液，震蕩懸浮，加入終濃度為50 μg/mL的溶菌素及10 mg/mL的溶菌酶，于37℃水浴鍋中水浴10 min，然后加入Trizol抽打混勻，按照程序提取mRNA，并立即檢測RNA純度和濃度。

應(yīng)用康為世紀HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CW0744）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存，選取合適引物（見表1）做PCR反應(yīng)，PCR循環(huán)基本條件：第一階段95℃預變性2 min，第二階段95℃變性 30 s，50～55℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，進行30次循環(huán)，最后72℃延伸5 min。所有樣品均為三個平行，以16S rRNA為內(nèi)參，采用電泳條帶灰度分析作為基因的相對表達水平。目的基因相對表達水平=目的基因灰度值/16s灰度值

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌對苯唑西林鈉耐受性的結(jié)果

金葡菌ATCC-29213與金葡菌ATCC-43300在2～512 μg/mL苯唑西林鈉不同濃度的作用下，均有菌株生長（見圖1），且在低于512 μg/mL濃度時細菌的存活率均高于10%，說明這兩株金葡菌對苯唑西林鈉都具有耐藥性，金葡菌ATCC-29213比ATCC-43300菌株的耐藥性更強。在后續(xù)的試驗中選擇金葡菌ATCC-29213為試驗菌株。

圖1 金黃色葡萄球菌對苯唑西林耐受性檢測Figure 1 The tolerance test of Staphylococcus aureus to oxacillin

2.2 牛角地黃湯對苯唑西林鈉抑菌作用的影響

苯唑西林濃度為512 μg/mL時金葡菌仍可生長，MIC高于512 μg/mL，表明其對苯唑西林具有耐藥性。當加入牛角地黃湯后苯唑西林在256 μg/mL和512 μg/mL的培養(yǎng)孔中金葡菌的增殖明顯被抑制金葡菌的存活率菌小于10%，在苯唑西林鈉濃度為128 μg/mL 時，高劑量的牛角地黃湯（20 mg/mL）對金葡菌的增殖抑制作用最強，存活率低于10%。在苯唑西林鈉濃度低于128 μg/mL時，金葡菌的增殖活性隨著牛角地黃湯的濃度增高而顯著降低，與不加牛角地黃湯的對照組差異顯著（P＜0.05，圖 2）。結(jié)果提示牛角地黃湯能增加耐藥金葡菌ATCC-29213菌株對苯唑西林鈉的敏感性，而且隨著牛角地黃湯的濃度增高，金葡菌的增殖被抑制得更加明顯。

圖2 牛角地黃湯對金黃色葡萄球菌ATCC-29213耐藥性的影響Figure 2 The effect of Niujiaodihuang decoction on the drug resistance of Staphylococcus aureus ATCC-29213

2.3 牛角地黃湯對金葡菌的轉(zhuǎn)錄組學分析

牛角地黃湯作用5 h后與對照組相比sRNA預測靶基因差異表達結(jié)果見圖3。在2.5 mg/mL濃度時差異sRNA靶基因上調(diào)的基因為338，下調(diào)的基因為210個，在5mg/mL濃度時上調(diào)的sRNA靶基因為204，下調(diào)的sRNA靶基因為319個，在10 mg/mL濃度下上調(diào)的sRNA靶基因為474，下調(diào)的sRNA靶基因為347個。聚類分析（見圖4）顯示這些基因參與廣泛的生物學功能，包括增殖、黏附、細胞周期、細菌感染、細菌抗性以及各種糖、脂肪的代謝途徑等。

圖3 預測差異sRNA靶基因統(tǒng)計Figure 3 Prediction of differential target genes sRNA statistics

圖4 牛角地黃湯處理后金葡菌轉(zhuǎn)錄組學差異基因功能聚類分析Figure 4 Niujiaodihuang decoction treatment of Staphylococcus aureuspost transcriptome analysis of differential gene function clustering

根據(jù)信號通路分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯對金葡菌細胞周期及細菌抗性相關(guān)基因的表達有明顯的影響。牛角地黃湯參與細胞周期相關(guān)基因ClpP的上調(diào)和FtsQ、MurG的下調(diào)，根據(jù)細胞周期信號通路分析ClpP基因的上調(diào)可抑制細胞進入染色體復制準備期G0期，MurG基因和FtsQ基因的下調(diào)可以抑制細胞進入G2/M期[15]，從而使金葡菌的增殖受到影響。glmU、murG基因與細菌細胞壁合成相關(guān)，在牛角地黃湯對金葡菌的抗生素抗性基因分析顯示，牛角地黃湯在濃度為2.5 mg/mL時，MurG基因上調(diào)，在濃度為10 mg/mL時，MurG基因下調(diào)，該研究結(jié)果提示，牛角地黃湯可能具有影響金葡菌細胞壁的合成作用。

2.4 金黃色葡萄球菌抗性相關(guān)基因表達分析

2.4.1 牛角地黃湯對金葡菌細胞壁合成相關(guān)基因表達的影響

牛角地黃湯藥物處理金黃色葡萄球菌后，提取mRNA反轉(zhuǎn)錄得到不同處理組金葡菌的cDNA，以此為模板進行PCR來檢測抗性相關(guān)基因的表達。所有樣品均為三個平行，以16S作為內(nèi)參（見圖5）進行灰度掃描檢測。

圖5 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌16s PCR電泳圖Figure 5 16s PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

glmU、murG基因是與細菌細胞壁合成相關(guān)基因[16-17]，murG基因主要功能是編碼金黃色葡萄球菌在合成細胞壁過程中的關(guān)鍵酶，當其表達增高時，可有效地改變金葡菌細胞壁的結(jié)構(gòu)，增加細胞壁厚度。牛角地黃湯處理后金葡菌murG、glmU基因的表達量呈現(xiàn)下降趨勢（見圖6）。這提示牛角地黃湯可能對金葡菌的細胞壁合成有影響。pbpB是細菌細胞壁合成所必需的也是苯唑西林的作用位點[18]，但是，牛角地黃湯對青霉素結(jié)合蛋白pbpB的mRNA的表達沒有顯著的影響（見圖6）。

圖6 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌murG、glmU、pbpB基因PCR電泳圖Figure 6 murG，glmU and pbpB genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

2.4.2 牛角地黃湯對金葡菌毒素及耐藥相關(guān)基因表達的影響

牛角地黃湯對耐藥輔助基因femB的表達呈顯著抑制作用，且具有濃度依賴性，當牛角地黃湯濃度達到20 mg/mL時，其表達量下降了60%。但對pbpBR的mRNA的表達沒有顯著的影響（見圖7）。牛角地黃湯對金葡菌殺白細胞毒素pvL基因的表達，沒有顯著影響（見圖8）。

圖7 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌femB and pbpBR基因PCR電泳圖Figure 7 femB and pbpBR genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

圖8 不同濃度牛角地黃湯處理的金葡菌pvL基因PCR電泳圖Figure 8 pvL genes PCR electrophoresis of Staphylococcus aureus treated with Niujiaodihuang decoction of different concentrations

3 討論

一直以來，人們對于治療細菌感染性疾病主要是應(yīng)用抗生素，抗生素類藥物主要通過干擾細菌的DNA、細胞壁以及蛋白質(zhì)等重要的生命活動而抑殺細菌，病原微生物在這種選擇性壓力下，很容易通過基因突變、質(zhì)粒轉(zhuǎn)座或改變細胞壁的結(jié)構(gòu)、代謝途徑等方式獲得針對不同抗生素的耐藥性[19]。pbpB是細菌所必需的，在革蘭氏陽性菌細胞壁合成過程中起著關(guān)鍵作用[18]，且與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有高親和性，由于pbps種類繁多，當高親和力的pbps被β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物結(jié)合而失去功能時，pbpBa的存在仍能維持細菌的生長，成為耐藥菌株。本研究提示亞抑菌濃度的牛角地黃湯與苯唑西林聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高金葡菌對苯唑西林的敏感性。并且能參與眾多的生命活動的調(diào)控。苯唑西林抑殺金葡菌的機制主要是作用于金葡菌的pbpB，通過影響菌體結(jié)構(gòu)而抑殺細菌，因此我們重點關(guān)注了與細胞壁合成和耐藥相關(guān)的基因，但并未發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯對pbpB或pbpBR的影響，說明牛角地黃湯對細菌細胞壁的干擾作用的位點與苯唑西林不同，pbpB并非牛角地黃湯的作用位點，glmU、murG基因是與細菌細胞壁合成相關(guān)基因[16-17]，牛角地黃湯對細胞壁結(jié)構(gòu)和細胞周期的干擾作用與murG和glmU基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)，并且其能降低耐藥相關(guān)基因femB的表達，這種作用可能是其與苯唑西林有協(xié)同作用的原因之一。在本次轉(zhuǎn)錄組中也發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯能調(diào)控細胞膜蛋白的表達、使蛋白質(zhì)的合成發(fā)生變化，糖類和脂肪類的轉(zhuǎn)運和合成也受到控制，在代謝過程中氨基酸代謝過程發(fā)生改變，特別是對細菌Agr二元調(diào)控系統(tǒng)關(guān)鍵基因有顯著下調(diào)，該系統(tǒng)與細菌的感染和致病力密切聯(lián)系[20]，這與我們的前期研究發(fā)現(xiàn)牛角地黃湯在亞抑菌濃度作用下可抑制金葡菌ATCC-29213毒力因子如溶血素、腸毒素A和B的分泌的結(jié)果相一致。

中藥在預防細菌感染方面有顯著效果，單味中藥在體外對痢疾志賀菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、病原性弧菌、大腸桿菌、傷寒沙門菌等具有較強的殺菌作用[21]，或具有逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的作用[22]。但是中藥制劑十分復雜，藥物的采集時間、煎制方法、藥物之間相互作用，均可能對藥物療效產(chǎn)生一定影響，雖本研究研究推測牛角地黃湯可以與抗生素聯(lián)合應(yīng)用增加金黃色葡萄球菌的敏感性，提高抗生素的藥效和抗感染作用，但是，在臨床對于治療細菌性感染是否有效，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

中藥牛角地黃湯與苯唑西林聯(lián)用具有協(xié)同作用，可增加耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株敏感性。其作用位點與pbpB和pbpBR基因的表達無關(guān)，與金葡菌耐藥基因輔助基因femB的表達及細菌細胞壁的合成murG和glmU的表達有關(guān)。