梁家充，朱 蘭，孫利民，楊紅遠，袁躍云，李東江，洪瓊花*

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/云南省畜禽遺傳資源保護和種質(zhì)創(chuàng)新工程實驗室，昆明 650224；2.云南省家畜改良工作站，昆明 650223）

約9000年前，綿羊在近東地區(qū)被馴化后成為人類重要的家畜物種[1]。家畜繁育全球化的生產(chǎn)和競爭導(dǎo)致了許多本地品種在世界上消失[2]。聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）估計，世界上已知的綿羊品種中有36%瀕臨滅絕或滅絕[3]。我國地方綿羊品種豐富，近年來，由于不合理地引種改良以及對地方綿羊種質(zhì)資源缺乏保護，使地方綿羊品種的數(shù)量急劇減少[4]。因此，對地方綿羊品種的遺傳多樣性進行評估，是中國綿羊遺傳資源保護的重要任務(wù)。云南省獨特的地勢結(jié)構(gòu)、氣候特征和多民族文化，決定了其具有豐富的生物多樣性資源，是我國生物多樣性的天然寶庫。

微衛(wèi)星（simple sequence repeat，SSR）是廣泛分布于生物體的整個基因組中的簡單重復(fù)序列，一般以2～6 bp的堿基為核心，重復(fù)幾次至幾十次[5]。由于這些標記具有高度多態(tài)性、共顯性遺傳性、保守性、基因組豐富性、選擇性中性行為、易檢測性和高重復(fù)性[6-9]，在品種遺傳多樣性分析、物種遺傳圖譜構(gòu)建和種間遺傳距離估測等方面具有重要的作用[10]?，F(xiàn)已有多項研究成功地利用微衛(wèi)星分子標記對家畜品種間的遺傳多樣性進行了描述[11-18]。

本研究采用具有高度多態(tài)的10個微衛(wèi)星位點，對云南8個地方綿羊品種的遺傳多樣性和系統(tǒng)進化關(guān)系進行研究，為今后更好地開展資源保護和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

本研究實驗羊為迪慶綿羊（DQ）53只、蘭坪烏骨綿羊（LP）59只、寧蒗黑綿羊（NL）60只、石屏青綿羊（SP）64只、騰沖綿羊（TC）61只、昭通綿羊（ZT）52只、麗江綿羊（LJ）60只和云南半細毛羊（BX）56只，共計8個綿羊品種465個樣本。8個云南地方綿羊品種的來源地理分布如圖1所示。抽取每只試驗羊5 mL頸靜脈血，置于EDTA抗凝采血管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 8個云南地方綿羊品種的來源分布Figure 1 Source distribution of 8 Yunnan native sheep breeds

1.1.2 主要試劑

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），鹽酸、瓊脂糖、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、溴化乙錠、溴酚蘭和甲醛等購自Promega公司；TaqDNA聚合酶和dNTP購自Takara生物工程有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司；微衛(wèi)星熒光引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3 引物設(shè)計

選擇的10對微衛(wèi)星引物序列由FAO提供，引物信息見表1。

表1 10對微衛(wèi)星引物信息Table 1 10 pairs of microsatellite primers

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

按照試劑盒的使用方法提取465個樣本血液的DNA。抽提的DNA于-20℃冷凍保存。對提取的基因組DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。

1.2.2 微衛(wèi)星PCR擴增檢測

PCR 反應(yīng)體系 20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各 1 μL，用雙蒸水補足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，退火（根據(jù)各引物退火溫度，見表1）30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸 5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測和12%聚丙烯酰胺電泳檢測，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行熒光毛細管電泳和基因型測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Popgene 1.31軟件計算下列遺傳多樣性的指標：觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne），觀測雜合度（Ho），期望雜合度（He），Nei's基因多樣性（H），F(xiàn)-統(tǒng)計量變異系數(shù)（Fst）和 Shannon-Weaver指數(shù)（I）；應(yīng)用POPGENE軟件通過Fst進行地域的地理分布分析；應(yīng)用程序pic-calc 0.6計算每個SSR的辛普森多樣性指數(shù)，也被稱為多態(tài)信息含量（PIC）；使用樣本共有片段的相似矩陣進行聚類分析，基因型之間的遺傳關(guān)系用基于數(shù)學(xué)平均數(shù)的非加權(quán)組平均法（UPGMA）確定，用 ntsys2.1軟件實現(xiàn)；用 STRUCTURE2.3.4計算 8個綿羊品種的所屬遺傳群體。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性變化

用10對微衛(wèi)星熒光引物進行擴增的465只羊的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行熒光毛細管電泳，產(chǎn)生4 650個電泳結(jié)果。部分結(jié)果如圖2所示。熒光毛細管電泳具有典型性峰形，易于判斷，保證了本試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

圖2 微衛(wèi)星位點毛細管峰圖Figure 2 Capillary peak diagram of microsatellite loci

10對微衛(wèi)星引物對8個綿羊品種共計465份樣本的多樣性分析可檢測到160個等位基因，469個基因型，各遺傳多樣性參數(shù)見表2。

表2 本研究中使用的10對微衛(wèi)星位點在465份樣本中的遺傳參數(shù)Table 2 The genetic parameters of 10 microsatellite loci in 465 samples

觀察等位基因數(shù)（Na）是基因分化最重要的指標之一，與群體、類型和地理位置直接相關(guān)。在465樣本中，每一個位點的Na值從7到23不等，平均值為16，擴增的基因型數(shù)目從15到82不等，平均為46.9。每個位點的 Ne在 2.121 到 6.355 之間，平均值為4.304。在整個樣本集里的160個等位基因中，44個（27.5%）是稀有的，頻率低于 0.05。Shannon 信息指數(shù)（I）的值從 0.987 到 2.287，平均為 1.745，期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）分別從 0.529 到 0.844（平均值=0.739），0.319 到 0.741（平均值=0.619）。Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）范圍從 0.529 到 0.843，平均為0.738。相對于遺傳分化系數(shù)（Fst），這10個微衛(wèi)星位點遺傳變異指數(shù)的范圍從0.045到0.194，均值是0.135。本研究每個微衛(wèi)星的多態(tài)性信息量（PIC）值從 0.481 到 0.829，平均為 0.706，除 SRCRP5為中度多態(tài)基因座外，其余都為高度多態(tài)基因座。

2.2 不同綿羊種群的遺傳多樣性比較

每個群體的觀察等位基因數(shù)（Na）平均范圍從4.8 到 8.8，平均為 6.775（見表 3）。每個群體的 Ho各不相同從 0.430 到 0.693，平均為 0.620。平均 I，H，和PIC每個位點在人群中變化分別從0.916到1.612（平均=1.311），0.485 到 0.722（平均值為 0.640），以及 0.429 到 0.689（平均=0.594）。其中石屏青綿羊（SP）的序列為最低的遺傳參數(shù)值；這一發(fā)現(xiàn)暗示了石屏青綿羊中樣本間密切相關(guān)。騰沖綿羊表現(xiàn)出最高的遺傳多樣性，除了Ho值外，所有其他遺傳參數(shù)都為最高值。

表3 10個微衛(wèi)星位點在8個綿羊品種中的遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters of 10 microsatellite loci in 8 sheep breeds

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢測

Hardy-Weinberg平衡檢測見表4，表中P值小于 0.05表示相應(yīng)群體的基因座處于 Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。由表4可知，騰沖綿羊8個基因座均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；麗江綿羊有4個基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；昭通綿羊有3個基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；寧蒗黑綿羊，蘭坪烏骨綿羊和迪慶綿羊有2個基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；云南半細毛羊和石屏青綿羊有1個基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。

表4 Hardy-Weinberg平衡檢測群體各基因座P值Table 4 The Hardy-Weinberg P values of each gene locus in the population

2.4 基于聚類分析的遺傳關(guān)系

由Popgene 1.31軟件計算的8個綿羊群體的Nei氏遺傳距離和Nei氏遺傳相似度結(jié)果可以看出（如表5），8個綿羊群體的Nei氏遺傳距離在0.090 7～0.767 0之間。其中，麗江綿羊和寧蒗黑綿羊的遺傳距離最近，為0.090 7；石屏青綿羊和云南半細毛羊的遺傳距離最遠，為0.767 0。這與樣本的地理來源分布一致（如圖2）。

表5 8個綿羊群體的Nei氏遺傳距離和Nei氏遺傳相似度Table 5 Nei's genetic identity and genetic distance of 8 sheep population

UPGMA聚類分析結(jié)果如圖3所示，8個綿羊品種聚為三大分支。麗江綿羊（LJ），寧蒗黑綿羊（NL），蘭坪烏骨羊（LP），石屏青綿羊（SP）和昭通綿羊（ZT）為第一分支；迪慶綿羊（DQ）為第二分支；云南半細毛羊（BX）和騰沖綿羊（TC）為第三分支。

2.5 云南綿羊的群體遺傳結(jié)構(gòu)

使用 STRUCTURE 2.2.3 軟件，通過貝葉斯聚類分析，評估了來自不同地區(qū)的465個樣本的群體結(jié)構(gòu)和分化。結(jié)果顯示，當遺傳組數(shù)量（K）為8時，Ln P[D]值達到最大（圖4A）。由于數(shù)值變化率的ΔK能夠比較準確地反映真正的K值，所以根據(jù)下列公式：

圖3 8個綿羊品種的UPGMA聚類圖Figure 3 The UPGMA Cluster graph of 8 sheep breeds

其中 L（K）即 LnP（D），s為標準差，m 為平均值，根據(jù)該公式可計算得出K與ΔK的折線關(guān)系圖（圖4B）。右圖看出，K=8時，ΔK達到最大，表明這465個樣本分別來自于8個種群。

圖4 評估群體結(jié)構(gòu)和分化Figure 4 Evaluate population structure and differentiation

在 K=8 時，STRUCTURE 2.2.3 軟件分析作圖（圖5），表明分析組別與樣本實際來源相符。

3 討論與結(jié)論

微衛(wèi)星的多態(tài)性能夠反映物種的進化歷史，群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的，其余的等位基因是進化過程中由該等位基因突變形成的。與許多其他的分子標記相比，SSRs有幾個優(yōu)點：它們很豐富，高度多態(tài)，共顯性遺傳，分析簡單，易于轉(zhuǎn)移。聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）建議，在對家養(yǎng)動物進行遺傳多樣性檢測時，每個品種檢測的個體數(shù)量至少應(yīng)達到25個個體，最好達到50個個體以上。在本試驗中，每個群的樣本含量分別都超過50只，達到了聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織建議檢測的要求。

3.1 Hardy-Weinberg平衡分析

根據(jù)Hardy-Weinberg法則，在一個沒有選擇、突變和遷移的大交配群體中，基因頻率和基因型頻率在世代間保持不變。造成Hardy-Weinberg不平衡的原因可能有近交、雜交、選擇作用、采樣偏差和零等位基因的存在。在本研究結(jié)果中，8個群體，10個位點，總計80個基因座中，出現(xiàn)13個基因座表現(xiàn)出不平衡現(xiàn)象。推測可能造成這種情況的主要原因：一是采樣的群體存在人工選擇影響，群體數(shù)量少，分布相對集中；二是可能與群體內(nèi)近交有關(guān)，因為羊群飼養(yǎng)的母羊較多，公羊少，羊群一般采用就近交配或是可能來源于同一頭種公羊，群體很難做到隨機交配，易造成基因丟失。這些都對群體的基因平衡產(chǎn)生了影響。

3.2 微衛(wèi)星標記的多態(tài)性

多態(tài)信息含量（PIC）是衡量片段多態(tài)性的一個指標。D.Botstein等[19]提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標，當PIC＞0.5時，該基因座為高度多態(tài)性，0.5＞PIC＞0.25 時為中度多態(tài)性，PIC＜0.25時為低度多態(tài)性。在本研究中的10個微衛(wèi)星位點中，DYMS1位點的PIC平均值最高，達到0.829，SRCRSP5位點的PIC平均值最低，為0.481，其余位點的PIC平均值都在0.807～0.534之間，均為高度多態(tài)性位點。因此，除SRCRSP5基因座多態(tài)信息含量和雜合度均明顯低于其他基因座，不適用于該種群的親緣鑒定和個體識別外，其余基因座均有較高的個體識別能力，可在相關(guān)鑒定中選用。

3.3 品種內(nèi)遺傳多樣性

PIC是評估一個群體遺傳多樣性的重要指標。王吉振等[20]利用4個微衛(wèi)星對7個綿羊品種間的遺傳關(guān)系進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各品種的平均PIC值為0.55。常爽等[21]利用9個微衛(wèi)星標記分析9個綿羊品種的PIC平均值為0.625。湯存?zhèn)サ萚22]利用10個微衛(wèi)星標記對新疆13個綿羊品種進行遺傳多樣性分析，PIC的平均值為0.680 2。在本研究中的8個綿羊品種中，騰沖綿羊的PIC平均值最高，平均達到0.689；石屏青綿羊的 PIC 平均值最低，平均為 0.429，為中度多態(tài)；其余位點的PIC平均值都在0.537～0.656之間，均為高度多態(tài)性，與上述研究結(jié)果相近。表明本研究8個綿羊品種的遺傳多樣性較為豐富，具有較大的育種潛力，同時也反映出了當前各品種資源的狀態(tài)良好。

期望雜合度（He）又稱基因多樣度，反映各群體在各位點上的遺傳變異，被認為是度量群體遺傳變異的一個最適參數(shù)。平均雜合度的大小可反映遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低，雜合度越高說明該群體內(nèi)的遺傳變異越大，遺傳多樣性也就越豐富；反之則群體內(nèi)的遺傳變異小，遺傳多樣性匱乏。柴文瓊等[23]利用5個微衛(wèi)星標記得出5個品種的觀察雜合度為0.448～0.680。呂慎金等[24]用 30 個微衛(wèi)星標記得出 8個綿羊品種的觀察雜合度為 0.539 0～0.71 35，與之前的研究結(jié)果相近。本研究結(jié)果表明，騰沖綿羊的He平均值最高，為0.729；云南半細毛羊的He平均值次之，為0.703；石屏青綿羊的He平均值最低，為0.489。說明騰沖綿羊遺傳變異最大，遺傳多樣性最豐富，其次是云南半細毛羊、寧蒗黑綿羊、迪慶綿羊、蘭坪烏骨羊、麗江綿羊和，昭通綿羊，最后是石屏青綿羊。

3.4 系統(tǒng)分化關(guān)系和遺傳結(jié)果

UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，麗江綿羊（LJ）和寧蒗黑綿羊（NL）的遺傳距離相近，與云南半細毛羊和騰沖綿羊的距離最遠。麗江綿羊（LJ），寧蒗黑綿羊（NL），蘭坪烏骨羊（LP），石屏青綿羊（SP）和昭通綿羊（ZT）為一大分支；迪慶綿羊（DQ）為一大分支類；云南半細毛羊（BX）和騰沖綿羊（TC）為另一大分支。結(jié)合圖1的群體來源地理分布，怒江的蘭坪烏骨羊，麗江的麗江綿羊和寧蒗綿羊地域接近，基因交流機會較多，遺傳距離也就越近。而石屏的石屏青綿羊與怒江和麗江的這幾個品種的綿羊遺傳距離相近，說明石屏青綿羊可能曾經(jīng)從該地引種。同樣的可看出昭通綿羊也曾從石屏引種。昭通的云南半細毛羊為人工培育品種，遺傳距離和騰沖的騰沖綿羊相近，說明云南半細毛羊可能從騰沖地區(qū)部分引種。而迪慶綿羊在海拔較高的迪慶，與周圍地區(qū)的麗江和怒江的綿羊表現(xiàn)出不同程度的遺傳多樣性，說明它們存在一定的地理隔離。

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，如圖5所示，麗江綿羊和寧蒗黑綿羊群體中對應(yīng)的顏色有部分交換，說明這兩個群體遺傳距離相近，這與聚類分析的結(jié)果相一致。如圖4B所示，當K=8時，ΔK達到最大，表明這465個樣本分別來自于8個種群。這與本研究中綿羊樣本實際采自8群體相符。

本研究結(jié)果表明 SRCRSP1、OarFCB304、OarJMP58、MAF33、DYMS1、ILSTS11、MAF214、CM140、ILSTS28可以作為有效的遺傳標記用于綿羊品種的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系研究。騰沖綿羊、云南半細毛羊、寧蒗黑綿羊、迪慶綿羊、蘭坪烏骨羊、麗江綿羊和昭通綿羊都具有較豐富的遺傳多樣性；騰沖綿羊遺傳變異最大，其次是云南半細毛羊、寧蒗黑綿羊、迪慶綿羊、蘭坪烏骨綿羊、麗江綿羊、昭通綿羊，石屏青綿羊變異最??；它們之間的遺傳分化關(guān)系與品種的地域、起源、馴化和相互引種有關(guān)。