顧子玄，金征宇，孫冰華，田耀旗

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

淀粉可以作為天然壁材包埋緩釋功能活性物質(zhì)[1]，且其具有良好的生物兼容性。淀粉基壁材制備常見的手段有化學(xué)、物理、酶法[2]或聯(lián)合改性的方法[3]。目前淀粉化學(xué)改性已有報(bào)道如交聯(lián)淀粉[4]和OSA淀粉[5]，但其存在交聯(lián)劑安全性、取代基分布不均勻等問題；物理改性方法局限于溫濕度、壓力等物理場的控制；而酶法改性以其種類多、來源廣、多酶聯(lián)合可以獲得不同效果等具有顯著優(yōu)勢[6]。

抗壞血酸(ascorbicacid,AA)，作為抗氧化劑在食藥、輕化領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但其活躍的二烯醇結(jié)構(gòu)使其在空氣和溶液中極易被氧化[7]生成脫氫抗壞血酸以及2,3-二酮古樂糖酸而失去功能活性。目前國內(nèi)外對保護(hù)其穩(wěn)定性做了諸多研究。如化學(xué)改性抗壞血酸使其變成鈉鹽鈣鹽或酯化成鹽[8-9]，這些方法雖然保護(hù)了其穩(wěn)定性但破壞了自身理化性質(zhì)。近年興起的微膠囊包埋技術(shù)[10-11]使抗壞血酸的光敏、熱敏穩(wěn)定性均得到極大的提高，并可以靶向傳遞抗壞血酸后進(jìn)行釋放，讓機(jī)體充分利用抗壞血酸的生物活性。

超支化結(jié)構(gòu)本身具有眾多分支可以作為包埋功能物質(zhì)的良好載體[12-13]。但目前超支化分子多來自化學(xué)單體通過縮聚反應(yīng)制備獲得，雖然其分支度可控，但化學(xué)合成的超支化分子由于安全性大多不適合作為食用壁材。本文采用酶法制備的超支化淀粉分子骨架，研究其作為一種新型的壁材包埋抗壞血酸，以期為功能活性物質(zhì)包埋、保護(hù)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

高直鏈玉米淀粉，山東諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司；超支化玉米淀粉(HBCS)，實(shí)驗(yàn)室自制[14]；試劑均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

冷凍離心機(jī)，真空冷凍干燥機(jī)，IS10傅立葉變化紅外光譜儀，美國Nicolet公司；Aduance Ⅲ 400 MHz全數(shù)字化核磁共振波譜儀，德國Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖苷鍵比例測定

采用1H核磁共振測定樣品的α-1,6糖苷鍵比例。參考李雯雯[15]的方法，用重水配制一定濃度的超支化淀粉乳，冷凍干燥后再重新分散于重水中。

1.2.2 超支化淀粉抗壞血酸包合物制備單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在對不同芯/壁比(質(zhì)量比)(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，準(zhǔn)確稱量一定量的超支化淀粉與一定體積的抗壞血酸溶液于磁力攪拌器上混均(表1)，固定溫度30 ℃，溫育時(shí)間30 min；在對不同溫度(10、20、30、40、50 ℃)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定溫芯/壁比(質(zhì)量比)1∶1，溫育時(shí)間30 min；在對不同時(shí)間(30、60、90、120、150 min)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定溫芯/壁比(質(zhì)量比)1∶1，溫度30 ℃。3 000×g離心5 min，取上清夜測定未被包合的抗壞血酸含量，抽濾、冷凍干燥得到超支化淀粉抗壞血酸包合物，計(jì)算相應(yīng)的包合率。

表1 不同芯/壁比(質(zhì)量比)配比Table 1 different proportions of core-to-wall ratio

注：CAA/(mg·mL-1)為抗壞血酸質(zhì)量濃度。

參考HU等[16]的方法并稍作修改。將抗壞血酸溶解于稀醋酸水溶液中配制成不同濃度的溶液，以1%可溶性淀粉溶液作為指示劑用I2/KI溶液滴定待測液。線性回歸方程為：

V(x)=2.012 5X+0.021 7 (R2=0.997 6)

(1)

式中：X為抗壞血酸含量，mg；V(x)為所消耗的VI2/VKI溶液體積，mL。

(2)

式中：m1為包埋的抗壞血酸含量；m0為包合物最大抗壞血酸含量。

1.2.3 超支化淀粉抗壞血酸包合物制備響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。在單因素基礎(chǔ)上選取出各因素的最佳范圍值，以包合率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)(表2)。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)因素水平和編碼Table 2 Level and code of factors by Box-Benhnken experiment

1.3 傅立葉變換紅外表征

分別取5 mg超支化淀粉、抗壞血酸、超支化淀粉與抗壞血酸物理混合物和超支化淀粉抗壞血酸包合物，按照1∶20的比例加入KBr細(xì)粉壓片。以空氣為背景，測定制備好的薄片。紅外掃描波數(shù)為4 000～400 cm-1，掃描32次，分辨率為4 cm-1。

1.4 包合物穩(wěn)定性

1.4.1 光敏穩(wěn)定性測定

稱取一定量的包合物于去離子水中在30 ℃下100 r/min磁力攪拌，分別在日光下照射30、60、90、120、150和180 min，測定釋放的抗壞血酸含量。以未包合的純抗壞血酸為對照。

1.4.2 熱敏穩(wěn)定性測定

稱取一定量的包合物于去離子水中，分別在20、30、40、60、80和100 ℃下100 r/min磁力攪拌1 h，測定釋放的抗壞血酸含量，全程注意避光操作。以未包合的純抗壞血酸為對照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Ducan法進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)，Origin Pro 2016對數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 超支化淀粉抗壞血酸包合物制備

2.1.1 超支化淀粉分支度

高直鏈玉米淀粉經(jīng)過超支化改性后，α-1,6糖苷鍵化學(xué)位移在4.99 ppm，α-1,4糖苷鍵化學(xué)位移在5.39 ppm(圖1)。超支化淀粉α-1,6糖苷鍵比例由7.08%增加到9.01%，提高了27.26%；其分支度從7.62%提高到9.90%，提高了29.92%(表3)。

圖1 高直鏈玉米淀粉和超支化玉米淀粉糖苷鍵化學(xué)位移Fig.1 Chemical shifts of glycosidic bonds of high amylose corn starch (HACS) and hyper-branched corn starch (HBCS)

表3 α-1,6糖苷鍵比例和分支度變化情況Table 3 Changes of ratio of α-1,6 glycosidic bonds and branching degree (BD)

樣品α-1,6 糖苷鍵比例/%BD/%HACS7.08±0.327.62±0.37HBCS9.01±0.479.90±0.57

注：BD分支化度，即α-1,6 糖苷鍵比例與α-1,4 糖苷鍵比例的比值。

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

芯/壁比對包合物制備的影響在30 ℃下溫育30 min后，芯/壁比對包合率的影響如圖2-a所示。

由圖2-a可知，隨著芯材的不斷增加，包合率不斷提高并趨向平穩(wěn)。一方面，在濃度差推動(dòng)下，抗壞血酸的羥基通過氫鍵與超支化玉米淀粉的多分支枝杈附近葡萄糖糖環(huán)上的羥基結(jié)合；另一方面，超支化玉米淀粉在水溶液中呈現(xiàn)的球形構(gòu)象松散程度導(dǎo)致枝杈的空腔大小對抗壞血酸包合產(chǎn)生了空間位阻。因此，在30 ℃溫育30 min條件下，抗壞血酸濃度差推動(dòng)力與超支化玉米淀粉空間位阻逐步達(dá)到平衡，隨著抗壞血酸的含量逐漸增加，超支化淀粉的分支枝杈可供包合的空腔逐漸達(dá)到飽和，在芯/壁比(質(zhì)量比)2.5∶1時(shí)達(dá)到最大包合率5.82%。由顯著性分析可知，芯/壁比2∶1時(shí)包合率為5.57%與芯/壁比2.5∶1和3∶1時(shí)包合率沒有顯著差異，因此，本著經(jīng)濟(jì)節(jié)約的考慮，選擇芯/壁比2∶1為最佳。

溫度對包合物制備的影響在芯/壁比1∶1，溫育30 min條件下，溫度對包合率的影響如圖2-b所示。

由圖2-b可知，隨著溫度的逐漸提高，包合率逐步達(dá)到最大值后略微降低。溫度升高，質(zhì)熱傳遞速率加快，溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，抗壞血酸在順濃度梯度下和空間位阻作用平衡，與超支化淀粉結(jié)合達(dá)到飽和，包合率為4.85%。然而，隨著溫度的不斷升高，一方面抗壞血酸自身會(huì)被氧化成脫氫抗壞血酸和2，3-二酮古樂糖酸，逐漸失去生物活性。另一方面，超支化淀粉、抗壞血酸、溶劑整體體系的熵增，球形構(gòu)象的超支化淀粉之間的碰撞幾率增加，分子間形成的枝杈空腔不穩(wěn)定，不利于抗壞血酸的包合。由顯著性分析可知，溫度為30 ℃和40 ℃時(shí)，包合率沒有顯著差異，因此選擇溫度30 ℃為最佳。

時(shí)間對包合物制備的影響在芯/壁比(質(zhì)量比)1∶1，30 ℃溫育條件下，時(shí)間對包合率的影響如圖2-c所示。

由圖2-c可知，隨著時(shí)間的延長，包合率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在包合60 min時(shí)達(dá)到最大包合率4.82%，隨后包合率逐漸降低，這可能是由于抗壞血酸自身的不斷氧化，或者是由于抗壞血酸在超支化玉米淀粉表面附近內(nèi)外濃度差的推動(dòng)下，部分吸附于超支化淀粉表面的抗壞血酸分子被解吸回溶液中。由顯著性分析可知，最佳包合時(shí)間為60 min。

a-芯/壁比(質(zhì)量比)對包合率的影響;b-溫度對包合率的影響;c-時(shí)間對包合率的影響圖2 工藝參數(shù)對包合率的影響Fig.2 Effect of time to the encapsulation rate

2.1.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以芯/壁比、時(shí)間和溫度為響應(yīng)變量，包合率為響應(yīng)值，建立包合工藝模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，模型方差分析如表5所示。

表4 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果Table 4 Box-Benhnken design and results

續(xù)表4

實(shí)驗(yàn)組別芯/壁比(A)時(shí)間(B)/min溫度(C)/℃包合率/%62.530304.817260305.078260204.679260305.3110260204.3611260305.07122.590304.92132.590305.23141.530203.51151.530404.00162.530304.4517260305.41

表5 模型方差分析Table 5 Analysis of variances for the model

注:*表示p<0.05，差異顯著。

從圖3可知，在芯/壁比(質(zhì)量比)固定的情況下，考察時(shí)間和溫度交互作用對包合率的影響。響應(yīng)曲面越陡峭說明包合率對時(shí)間和溫度的變化更敏感，同時(shí)等高線圖也更加橢圓，反映出交互作用對包合率的明顯變化。

由Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)為芯/壁比1.52∶1(質(zhì)量比)、時(shí)間76.38 min和溫度33.21 ℃，此時(shí)包合率達(dá)到5.45%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，修正為芯/壁比1.5∶1(質(zhì)量比)、時(shí)間75 min和溫度33 ℃進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，包合率為5.19%，與模型預(yù)測包合率相符合。因此，該模型可以較好的評價(jià)超支化玉米淀粉與抗壞血酸的包合率。

a-響應(yīng)曲面;b-等高線圖圖3 時(shí)間溫度交互作用對包合率的影響Fig.3 Effect of interaction of time and temperature to the encapsulation rate

2.2 傅立葉變換紅外結(jié)構(gòu)表征

圖4 抗壞血酸、超支化淀粉、超支化淀粉抗壞血酸物理 混合物和超支化淀粉抗壞血酸包合物的紅外光譜Fig.4 The infrared spectra of ascorbic acid (AA), highly- branched corn starch (HBCS), highly-branched corn starch/ ascorbic acid physical mixture (PM) and highly-branched corn starch-ascorbic acid inclusion complex (HBCSAA)

2.3 包合物穩(wěn)定性

圖5 包合物與純抗壞血酸光熱穩(wěn)定性Fig.5 Photostability and themostability of highly-branched starch-ascorbic acid inclusion complex and pure ascorbic acid

由圖5可知，隨著溫度的增加和光照時(shí)間的延長，包合物與未包合的抗壞血酸穩(wěn)定性均呈現(xiàn)下降的趨勢。但包合物的穩(wěn)定性下降程度始終緩于未包合的抗壞血酸穩(wěn)定性。在溫度100 ℃時(shí)，包合物抗壞血

酸穩(wěn)定性比未包合的高13.88%；當(dāng)光照180 min后，未包合的抗壞血酸已經(jīng)完全氧化而包合物還有10.23%的抗壞血酸殘留。因此，超支化淀粉作為壁材可以有效的保護(hù)抗壞血酸并提高其穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與展望

本研究在最佳工藝條件芯/壁比(質(zhì)量比)1.5∶1、時(shí)間75 min和溫度33 ℃下，制備出超支化淀粉-抗壞血酸包合物，包合率為5.19%。超支化淀粉通過氫鍵與抗壞血酸形成包合物。經(jīng)包合后，包合物在溫度100 ℃時(shí)，抗壞血酸熱敏穩(wěn)定性提高13.88%，而光照180 min后，其光敏穩(wěn)定性提高10.23%。后續(xù)工作考慮對該包合物進(jìn)行模擬體外釋放研究，以期考察其是否具有腸胃靶向釋放功能。